沉默c-fos基因對PM2.5染毒人支氣管上皮細胞癌基因和凋亡相關基因表達的影響

蔡 穎 ，鄭 凱，秦雙建，李柏茹，余淑苑，劉 寧，季佳佳，張朝暉*，徐新云，*

(1．南華大學公共衛生學院，湖南 衡陽421001；2．深圳市疾病預防控制中心，廣東深圳 518055；3．中南大學湘雅公共衛生學院，湖南 長沙 410078)

近年來隨著我國經濟的快速發展，環境問題對人類造成的不良影響也日益顯現出來。大氣細顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)作為大氣污染物中的一種，因其成分復雜，由有機碳化合物、硫酸鹽、硝酸鹽及多種金屬元素組成，許多流行病學隊列研究發現，長期暴露于PM2.5環境中與死亡風險增加相關[1]，特別是PM2.5長期飄浮在空氣中易經人體呼吸道進入肺泡，對肺功能造成不同程度的影響，國內外許多研究報道，PM2.5是導致呼吸系統疾病發展的重要因素之一[2-3]，與PM2.5這一危險因素密切相關的呼吸系統相關疾病的死亡率逐年增高，增加了全球疾病負擔，可見空氣污染對呼吸系統的危害不容小視。

我們的前期研究發現，PM2.5可致HBE人支氣管上皮細胞(human bronchial epithelial cells，HBE cells)癌基因c-fos mRNA和蛋白表達水平升高[4]，且已有研究表明，PM2.5暴露大鼠后引起肺組織中c-fos在mRNA和蛋白表達水平上升[5]。目前，國內外關于研究PM2.5毒作用過程中關鍵基因是如何發揮作用的報道尚少，因此探討c-fos基因是否在PM2.5致HBE細胞毒性作用中發揮作用，有重要意義。我們采用RNA干擾技術構建c-fos基因沉默細胞株，研究c-fos基因在PM2.5對HBE細胞凋亡相關基因及癌基因影響中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM培養基，購于美國Hyclone公司；胎牛血清，購于美國Gibco公司；RNeasy Mini Kit，購于德國Qiagen公司；基因反轉錄試劑盒(Prime Scrip RT reagen kit)和反轉錄-聚合酶鏈反應核酸染料檢測試劑盒(SYBR PrimeScript RT-PCR kit)，購于日本TaKaRa公司；基因PCR引物由上海生工合成。c-myc兔抗一抗(#9402)、P53兔抗一抗(2527S)、c-fos兔抗一抗(2250S)、購于美國Cell Signaling公司；Caspase-3鼠抗一抗(SC-7272)、Caspase-8鼠抗一抗(sc-81656)、kras鼠抗一抗(SC-47778)、β-actin鼠抗一抗(SC-47778)均購于美國Santa Cruz公司，二抗(羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP)購于美國Thermo Scientific公司；HBE細胞購于中國上海細胞庫；中流量大氣采樣器(TH-150C III型)購于武漢市天虹儀器有限責任公司；7500實時熒光定量PCR儀購于美國Applied Biosystems公司；垂直電泳系統(Mini-protean Tetra)購于美國Bio-Rad公司；冷CCD成像系統購于美國GE公司。

1.2 PM2.5樣品處理

用中流量采樣器進行PM2.5采樣，流量為100 L/min，每次采樣24 h，連續采樣3 d，采樣地點為山西省太原市。將吸附有PM2.5的濾膜稱質量后剪成2 cm×2 cm的小塊濾膜，并浸沒于加有超純水的燒杯中，錫箔紙密封燒杯口后超聲振蕩30 min，取出殘留的濾膜后，將PM2.5樣品懸濁液轉移到真空冷凍物料盤中，并置于-80℃冰箱冷凍24 h，使用真空冷凝法干燥得到PM2.5樣品；于紫外燈滅菌1～2 h后溶解于超純水中，制成PM2.5儲備液，分裝后于-20℃冰箱保存待用，使用前振蕩混勻。

1.3 c-fos基因沉默細胞株的構建

根據NCBI c-fos的mRNA全序列，設計c-fos shRNA以及干擾對照序列shRNAc，shRNA寡核苷酸鏈由上海生工公司合成。構建特異性抑制HBE細胞中c-fos基因表達的慢病毒表達載體，酶切和傳統菌落PCR技術提示重組載體構建成功。按照Lenti-XTMLentiviral Expression Systems試劑盒說明書步驟將pLVX-c-fos-shRNA包裝慢病毒，并進行濃縮純化及滴度測定。將慢病毒液感染HBE細胞，24 h后換液，加入含1.3 μg/mL嘌呤霉素、10%胎牛血清的高糖DMEM培養基培養2周，使用實時熒光定量PCR和Western blot分別從mRNA和蛋白水平驗證c-fos基因表達的抑制效果，鑒定c-fos基因沉默細胞株是否構建成功。

1.4 PM2.5染毒HBE細胞和c-fos基因沉默細胞

使用DMEM完全培養基(含10%胎牛血清)于37℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養HBE細胞和c-fos基因沉默細胞，待細胞狀態穩定且匯合度達80%時使用PM2.5培養液進行染毒，依據前期研究，PM2.5染毒的IC50為70.12 mg/mL，因此采用50 mg/mL作為PM2.5的染毒濃度，以兩種細胞未染毒組作為陰性對照培養于不含血清的DMEM培養基中，于37℃、CO2體積分數為5%條件下培養24 h，檢測部分癌基因與凋亡相關基因的mRNA和蛋白表達水平。

1.5 實時熒光定量PCR檢測癌基因和凋亡相關基因mRNA水平表達

將處理后的細胞用PBS清洗3次，使用RNeasy Mini Kit提取細胞總RNA，收集PM2.5處理后的HBE細胞和c-fos基因沉默細胞，分別提取RNA，按基因反轉錄說明書盒試劑逆轉錄為cDNA，并作為模板進行PCR擴增，對癌基因c-myc、k-ras、p 53、c-fos及凋亡相關基因Caspase-3和Caspase-8mRNA水平進行定量檢測。PCR反應條件為95℃預變性30 s；95℃變性5 s，55℃退火延伸30 s，共40個循環。以GAPDH作為內參，采用 2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達水平。目的基因PCR引物序列見表1。

表1 目的基因熒光定量PCR引物序列

1.6 Western blot檢測癌基因和凋亡相關基因在蛋白水平的表達

將處理后的細胞用PBS清洗3次，加入適量含蛋白酶抑制劑的IP裂解液于冰床上裂解細胞30 min，充分裂解后收集細胞，于4℃、10 000 r/min條件下離心20 min，收集上清液，按照BCA蛋白濃度定量法對收集的蛋白樣品進行定量。加5×上樣緩沖液，100℃變性8 min。配制10%分離膠，5%濃縮膠，依次進行蛋白上樣。SDS-PAGE凝膠電泳后，使用濕轉法90 min將蛋白完全轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶于室溫搖床上封閉2 h，分別使用相應的一抗于4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，加入相應的二抗，于室溫搖床上孵育50～60 min，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，使用冷CCD成像系統進行顯影，β-actin作為內參，使用Image J軟件分析灰度值并計算蛋白相對表達量。

1.7 統計學方法

所有實驗重復3次，實驗數據以±s表示。采用SPSS 24.0統計軟件進行統計學分析，組間比較使用方差分析，兩兩比較采用t檢驗，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 HBE細胞c-fos mRNA表達水平檢測

qPCR檢測c-fos mRNA表達水平結果見圖1，轉染干擾序列shRNAc細胞中c-fos mRNA相對表達水平與HBE正常細胞比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，c-fos基因沉默細胞中c-fos mRNA表達水平與HBE正常細胞比較，下降70.1%，差異有統計學意義(P＜0.01)。

2.2 c-fos蛋白表達水平檢測

圖1 qPCR檢測c-fos基因沉默細胞中c-fos mRNA表達水平

圖2 Western blot檢測c-fos基因沉默細胞中c-fos蛋白表達水平

Western blot檢測c-fos蛋白表達水平結果見圖2，與HBE正常細胞比較，轉染干擾序列shRNAc細胞中c-fos蛋白相對表達水平差異無統計學意義(P＞0.05)，c-fos基因沉默細胞中c-fos蛋白表達降低53.7%，差異有統計學意義(P＜0.01)，表明c-fos基因沉默細胞株構建成功。

2.3 HBE細胞c-fos基因沉默前后PM2.5對癌基因及凋亡相關基因mRNA表達水平的影響

qPCR檢測癌基因c-myc、k-ras、c-fos、p53及凋亡相關基因Caspase-3、Caspase-8的mRNA表達水平變化，結果見圖3、圖4，PM2.5染毒HBE正常細胞后，與未染毒組比較，c-myc和k-ras mRNA表達水平分別升高30.46%、27.17%，差異均有統計學意義(P＜0.05)，c-fos、Caspase-3、Caspase-8 mRNA表達水平分別升高50.78%、71.91%、74.16%，p53表達水平降低12.27%，差異均有統計學意義(P＜0.01)。PM2.5染毒c-fos基因沉默細胞后，與未染毒組比較，c-myc、k-ras mRNA表達水平分別下降13.08%、5.39%；Caspase-3、Caspase-8 mRNA表達水平分別下降25.03%和21.37%，差異均有統計學意義(P＜0.05)。p53 mRNA下降53.39%，差異具有統計學意義(P＜0.01)，而c-fos基因被沉默后，PM2.5誘導其表達增加，上升水平為240.96%，差異具有統計學意義(P＜0.01)。c-fos基因沉默細胞染毒組與HBE正常細胞染毒組比較，c-myc和c-fos mRNA表達水平分別下降28.43%、32.46%，差異均有統計學意義(P＜0.05)。kras、p53、Caspase-3和Caspase-8 mRNA表達水平分別下降36.54%、41.05%、70.63%、74.70%，差異均有統計學意義(P＜0.01)。

圖4 PM2.5染毒HBE細胞和c-fos基因沉默細胞后凋亡相關基因mRNA表達水平變化

2.4 c-fos沉默前后PM2.5對癌基因及凋亡相關基因在蛋白表達水平的影響

Western blot檢測c-myc、p53、Caspase-3蛋白表達水平的變化，結果見圖5和圖6。PM2.5染毒HBE正常細胞后，與HBE正常細胞未染毒組比較，c-myc及Caspase-3表達水平分別升高17.88%和19.10%，p53下降16.78%，差異均有統計學意義(P＜0.05)。PM2.5染毒c-fos基因沉默細胞后，與未染毒組比較，c-myc表達水平下降19.15%，差異有統計學意義(P＜0.05)。Caspase-3和p53蛋白表達無明顯變化。c-fos基因沉默細胞染毒組與HBE正常細胞染毒組比較，c-myc蛋白表達水平下降27.08%，差異有統計學意義(P＜0.01)。Caspase-3和p53蛋白表達無明顯變化。

圖5 PM2.5染毒HBE細胞和c-fos基因沉默細胞后c-myc和Caspase-3蛋白表達水平

3 討論

c-fos癌基因是即刻早期基因(immediate early gene，IEG)家族中的一員，IEG是一組能對各類外界刺激的傳入信息在數分鐘之內迅速表達的原癌基因，c-fos的功能是通過調節特定靶基因的方式將細胞表面被刺激的短程信號與細胞長期反應相耦連。c-fos基因在大多數正常細胞中處于極低水平的表達，在細胞刺激因子誘導時，常發生短暫而迅速的表達，能夠將細胞外的短期信號與細胞內長期適應性反應連接起來，也被稱為第三信使。目前許多研究認為c-fos基因與細胞增殖、分化及凋亡有關，在腫瘤的發生發展過程中也起到一定的調控作用，如乳腺癌、結腸癌、肺癌等癌癥中能檢測到過度表達的c-fos基因[6-8]。通過查閱文獻，未見報道研究c-fos基因沉默在PM2.5毒性作用中的分子機制，因此，本研究通過構建靶向抑制c-fos基因表達的shRNA慢病毒載體，沉默HBE細胞中c-fos基因表達后，經qPCR鑒定，c-fos基因沉默細胞中c-fos mRNA表達量較正常HBE細胞降低70.1%，Western blot鑒定，c-fos基因沉默細胞中c-fos蛋白表達量較正常HBE細胞降低53.7%，表明c-fos基因沉默細胞株構建成功。

PM2.5已被國際癌癥研究機構認定為普遍和主要的環境致癌物，隨著空氣中PM2.5濃度增加，對環境及人體健康的影響程度越嚴重，誘發心血管及呼吸系統疾病，包括哮喘，肺癌等[9-10]。有研究表明，腫瘤的發生發展與啟動或增強細胞凋亡機制密切相關，當細胞凋亡發生紊亂時，往往會導致多種疾病包括癌癥的發生[11-12]。研究表明[13]，c-myc基因在癌組織中擴散率高于正常組織，且與細胞潛在的增殖能力呈正相關，對腫瘤的發生具有促進作用。Huang等[14]研究發現，c-myc的過表達能顯著減弱shUSP13對HCC細胞生長的抑制作用，從而促進肝細胞癌的進展。在腫瘤基因中，ras家族中k-ras基因的高突變率一直深受學者們關注[15]，包括肺癌、胰腺癌、結腸癌等已經報道了k-ras基因的激活突變[16]。

腫瘤抑制基因p53位于第17號染色體短臂上，它在細胞周期、DNA損傷修復中起著重要的調控作用[17]。數據顯示，p53基因的突變能促進腫瘤細胞的增殖與遷移[18]。Caspase家族是一種半胱氨酸蛋白酶，是執行細胞凋亡的關鍵分子群[19]。有研究報道，PM2.5暴露能通過激活凋亡相關基因包括Caspase-3、Caspase-8等誘導細胞凋亡[20-21]。本次研究發現，采用50 mg/mL PM2.5混懸液染毒正常HBE細胞后，cmyc、k-ras、Caspase-3和Caspase-8 mRNA水平較陰性對照組明顯升高(P＜0.05)，當PM2.5染毒c-fos基因沉默細胞后，以上基因的mRNA表達水平出現不同程度的下降(P＜0.05)，即c-fos基因沉默后對PM2.5誘導的cmyc、k-ras、Caspase-3和Caspase-8基因表達升高具有一定的抑制作用，而c-fos基因由于被沉默后表達抑制，在PM2.5刺激作用下表達水平再次升高，也再次表明了PM2.5的毒性作用。在蛋白質水平，c-myc和Caspase-3蛋白同樣出現表達降低，提示c-fos基因對凋亡相關基因與癌基因的激活存在一定抑制作用。

綜上所述，本文研究結果顯示，c-fos基因沉默細胞暴露于PM2.5后，與正常HBE細胞相比較，癌基因c-myc、k-ras、c-fos、p53及凋亡相關基因Caspase-3和Caspase-8的mRNA表達水平明顯改變，c-myc、p53及Caspase-3在蛋白表達水平也發生變化，提示c-fos基因可能是參與PM2.5發揮毒理學作用的一個有重要價值的調控基因，以及本研究建立的c-fos基因沉默細胞，還可用于后續深入研究PM2.5的致癌分子機制及毒理學機制。