骨寶丸對維甲酸誘導小鼠骨質疏松的防治作用及機制探討

張念軍 區作明,3 李雪 陳茹 王昌兵 劉少華 湯琪 楊海韻 鄧向亮

1.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510006 2.廣州中醫藥大學附屬佛山中醫院骨十科，廣東 佛山 528000 3.佛山市高明區中醫院骨科，廣東 佛山 528500 4.南方醫科大學順德醫院中醫科，廣東 佛山 528300 5.廣東藥科大學中醫學院，廣東 廣州 510006

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種骨骼系統疾病，臨床上以骨量、骨密度損失等為主要特征，多見于中老年人，尤以絕經后女性為甚，成為21世紀的第5大疾病[1]。我國是OP發病的大國，隨著我國人口老齡化的進一步加劇，據預測，2020年我國將有近3億OP患者， 約占世界的50%以上[2]。OP主要分為三大類：原發性骨質疏松癥、繼發性骨質疏松癥和特發性骨質疏松癥[1]。其中，原發性骨質疏松癥最為常見，又可分為Ⅰ型骨質疏松癥即絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)及Ⅱ型骨質疏松癥即老年性骨質疏松癥；原發性骨質疏松中，PMOP占大多數[3]。女性在絕經后即開始出現骨量丟失的增加，絕經后5～10年是骨丟失的高峰期。佛山市中醫院使用骨寶丸治療骨質疏松癥，取得了較好的臨床療效。骨寶丸主要由熟地、仙茅、山萸肉、淫羊藿、淮山藥、龜板、當歸等藥物組成，具有補肝腎、強筋骨、健脾胃、益氣血的功效[4]。經臨床應用30余年，證實骨寶丸對骨質疏松、骨折愈合遲緩、股骨頭無菌性壞死及肝腎虧損諸癥，有理想的臨床療效[5-9]。然而目前的研究多以臨床療效評價為主，缺乏相關的藥理實驗，尤其是作用機制和物質基礎尚未清楚。因此，本研究參考文獻用維甲酸誘導小鼠以建立骨質疏松模型，考察骨寶丸對小鼠骨質疏松的防治作用，并從骨形成的角度探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物：SPF級健康BALB/c小鼠30只，雌性，體質量 18～22 g，購于廣東省醫學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(粵)2013-0002，飼養于廣州中醫藥大學SPF級動物實驗室。

1.1.2主要藥物與試劑：骨寶丸(佛山市中醫院院內制劑，粵藥制字Z20060052，由熟地、仙茅、山萸肉、淫羊藿、淮山藥、龜板、當歸等10多種藥物組成)；維甲酸，為美倫生物科技有限公司生產；小鼠骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、血清骨鈣素(osteocalcin，OC)、血清Ⅰ型原膠原N-端前肽(procollagen type 1 N-peptide，P1NP)ELISA 試劑盒，均為博奧森生物公司生產；小鼠骨特異性堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，BALP)ELISA 試劑盒由CUSABIO公司生產。

1.1.3主要儀器： Micro-CT(Aloka Latheta LCT200，Hitachi-Aloka)；電熱恒溫培養箱(DHP-9272，上海齊欣科學儀器有限公司)；酶標儀(Multiskan FC，Thermo)。

1.2 方法

1.2.1動物分組與造模：小鼠分成 5組，即正常組(Control)、模型組(Model)、骨寶丸高劑量組(GBW-H)、骨寶丸中劑量組(GBW-M)和骨寶丸低劑量組(GBW-L)，每組6只。實驗第 1～30 天，除正常組給予RO水之外，其余各組小鼠灌服維甲酸造模，劑量為100 mg/kg，每天一次，連續30 d。

1.2.2動物給藥：按人每天服用劑量的10倍劑量作為小鼠給藥的中劑量(即3 g/kg)，分別以中劑量組的2倍、1/2倍劑量作為高劑量(6 g/kg)和低劑量(1.5 g/kg)。實驗第 1天開始，骨寶丸各劑量組小鼠分別灌胃給予對應劑量的藥物溶液，給藥體積為 0.2 mL/10 g，每天1 次，連續30 d；正常組和模型組給予等量RO水。

1.2.3觀察股骨形態：取小鼠股骨，稱取質量，利用電子數顯卡尺測量股骨中間段直徑和股骨長度；取股骨經10%中性甲醛固定、5%甲酸脫鈣，然后按常規方法制備石蠟切片，并進行HE染色，光學顯微鏡下觀察股骨組織形態，并拍照。

1.2.4檢測骨密度(bone mineral density，BMD)：利用Micro-CT掃描小鼠股骨，計算BMD(mg/cm3)。

1.2.5ELISA檢測：摘眼球取血至干凈的EP管，樣品在室溫靜置20 min，然后離心(800 g，20 min)，分離血清后按照ELISA試劑盒的說明檢測血清中BMP-2、OC、BALP、P1NP的含量。

1.3 統計學分析

數據以均數±標準差的形式表示，采用 Graphpad 5制作統計圖，并利用其自帶的統計軟件進行方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對小鼠股骨形態的影響

與正常組比較，模型組小鼠的股骨在形態上發生以下變化：肉眼觀察表面顏色顯枯白色、股骨頭變細(圖1)，股骨直徑和質量均顯著減小(P<0.01，圖1B、1C)，股骨長度未見顯著變化(圖1D)；這提示維甲酸造成小鼠股骨形態發生了較顯著的改變。與模型組比較，骨寶丸各劑量組小鼠的股骨形態有較大改善，其中肉眼觀察骨形態較粗壯，并呈現淡紅色(圖1 A)；股骨頭、骨質量和股骨直徑均顯著大于模型組(P<0.01或P<0.05，圖1B、圖1C)。

圖1 小鼠股骨形態 A：股骨形態；B：股骨直徑(橫徑)；C：股骨質量；D：股骨長度；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。Fig.1 Morphology of mouse femur. A: morphology of the femur; B: diameter of the femurs (Transverse diameter); C: weight of the femurs; D: length of the femurs; Compared with model group, *P<0.05, **P<0.01.

圖2 骨寶丸對維甲酸誘導的小鼠股骨組織的影響(×100)Fig.2 Effect of GBW on the tissue of femur in retinoic-induced mice (×100)

2.2 對小鼠股骨組織的影響

本研究利用HE染色法觀察小鼠股骨組織變化情況，實驗結果如圖2所示，正常組小鼠的骨髓組織豐富而內含大量的骨髓細胞，而模型組的骨髓組織顯著減少；與模型組比較，骨寶丸各劑量組的骨髓組織顯著增多。由于正常的骨髓組織內含大量骨髓細胞，其中包括部分紅細胞，這使正常的股骨表面隱隱顯現淡紅色，因此結果也可以部分解釋了模型組小鼠的股骨經肉眼觀察顯枯白色的原因。

2.3 對股骨密度的影響

BMD是骨質量的一個重要標志，反映骨質疏松程度，預測骨折危險性的重要依據。本實驗研究結果顯示，與正常組比較，模型組的BMD顯著降低(P<0.05)；而與模型組比較，骨寶丸各劑量組的BMD有不同程度的升高，其中高、中劑量組與模型組比較差異均具有統計學意義(P<0.05，圖3)。

圖3 骨寶丸對維甲酸誘導的小鼠股骨BMD的影響(與模型組比較，*P<0.01)Fig.3 Effect of GBW on the BMD of femur in tretinoin-induced mice (Compared with model group, **P<0.01)

2.4 對血清OC和P1NP分泌的影響

血清中OC和P1NP是反映骨形成的標志物，在絕經期骨質疏松婦女中這兩個指標都會存在升高的現象，因此成為評價絕經期骨質疏松程度的重要指標。本實驗采用ELISA試劑盒檢測了小鼠血清中OC和P1NP的分泌水平。結果顯示，模型組血清中OC和P1NP水平顯著高于正常組(P<0.05)；與模型組相比，骨寶丸各劑量組OC和P1NP水平含量有不同程度降低：其中，骨寶丸各劑量組OC水平呈一定的劑量依賴性降低，且與模型組比較差異均有統計學意義(P<0.01或0.05，圖4 A)；同時，骨寶丸中、高劑量組的P1NP水平顯著低于模型組(P<0.01或0.05，圖4B)。

2.5 對血清BMP-2和BALP分泌的影響

為了進一步探討骨寶丸防治維甲酸誘導的小鼠骨質疏松形成的機制，本實驗采用ELISA試劑盒檢測了小鼠血清中BMP-2和骨形成分化標志酶BALP的分泌水平。實驗結果如圖5所示，模型組小鼠血清中BMP-2和BALP分泌水平均顯著低于正常組(**P<0.01)；而骨寶丸各劑量組小鼠血清BMP-2和BALP分泌水平都不同程度地高于模型組的，其中骨寶丸各劑量組小鼠血清BMP-2分泌水平與模型組的比較差異均具有統計學意義(P<0.05或0.01，圖5 A)，骨寶丸高、中劑量組小鼠血清BALP分泌水平與模型組的比較差異均具有統計學意義(P<0.05或0.01，圖5B)。

圖4 骨寶丸對維甲酸誘導的小鼠血清OC(A)和P1NP(B)分泌水平的影響(與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01)Fig.4 Effect of GBW on the secretion of OC (A) and P1NP (B) in the serum of tretinoin-induced mice (Compared with model group,*P<0.05,**P<0.01)

圖5 骨寶丸對維甲酸誘導的小鼠血清BMP-2(A)和BALP(B)分泌水平的影響(與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01)Fig.5 Effect of GBW on the secretion of BMP-2 (A) and BALP (B) in the serum of tretinoin-induced mice (Compared with model group, *P<0.05, **P<0.01)

3 討論

本研究考察骨寶丸對維甲酸誘導小鼠制備骨質疏松的影響，并從影響骨形成角度入手探討其作用機制。實驗結果表明骨寶丸對維甲酸誘導小鼠骨質疏松有顯著的防治作用，其作用機制可能與促進股骨形成有關。

PMOP在原發性骨質疏松中所占比例較高，因此無論是臨床還是實驗研究均較多。在動物實驗研究中，卵巢切除和維甲酸誘導是制備絕經后骨質疏松模型的常用方法，其中維甲酸誘導具有操作簡單、重復性高、動物無死亡等優點，所以本研究參考文獻方法采用維甲酸誘導小鼠制備骨質疏松模型[10-11]。實驗結果表明，維甲酸誘導的小鼠股骨質量、密度、直徑、骨髓組織均顯著減少，而且血清中骨代謝標志物OC和P1NP 分泌水平顯著升高，而促進骨形成相關蛋白BMP-2和BALP分泌水平顯著降低。本研究結果與臨床報道的PMOP具有較高的一致性，即PMOP為高轉換型的骨質疏松，除了具有骨質疏松的一般特性，還因為骨轉換活躍，同時存在亢進的骨吸收與骨形成，臨床可見骨代謝標志物OC和P1NP 分泌水平升高[12-13]。

佛山市中醫院的院內制劑骨寶丸臨床治療骨質疏松有很好的療效。本實驗結果表明骨寶丸能拮抗維甲酸誘導的小鼠股骨質量、密度、直徑、骨髓組織減少，該結果與臨床報道的骨寶丸有改善PMOP患者骨密度、減少骨量丟失的功效相吻合[6]，同時與骨寶丸提高卵巢切除誘發骨質疏松大鼠的骨密度的實驗報道一致[5]。實驗結果提示骨寶丸對維甲酸誘導的小鼠骨質疏松有防治作用。為進一步探討骨寶丸防治骨質疏松的作用機制，本研究考察了小鼠血清中骨形成相關代謝物OC、P1NP、BMP-2和BALP的分泌水平。結果表明骨寶丸可拮抗維甲酸誘導的骨質疏松小鼠血清中OC和P1NP的分泌。OC和P1NP是敏感性好、特異性高的骨形成標志物，一般反映骨細胞活性及骨功能狀態，然而PMOP作為高轉換型的骨質疏松，骨形成和骨吸收都較為活躍，臨床報道患者血清OC和P1NP會出現升高[12-14]，其中骨形成和骨吸收都會釋放OC，這可能是OC在PMOP中升高的主要原因[15]。此外，本研究結果還顯示骨寶丸可拮抗維甲酸對小鼠血清BALP和BMP-2的抑制作用。BMP是一類與骨組織生長相關的多功能糖蛋白，BMP-2是其中誘導成骨活性最強的蛋白之一[16]；BALP是由成骨細胞分泌的一種糖蛋白，具有促進骨組織的生成作用，是骨形成的標志物之一[17]； BMP-2 通過促進BALP 分泌，誘導BMSCs 向骨形成分化[18]。通過局部植入BMP-2不但可以促進骨折愈合[19]，還能改善骨質疏松動物的骨質[20]。因此，實驗結果還提示骨寶丸防治維甲酸誘導的小鼠骨質疏松可能與促進骨形成有關。

綜上所述，骨寶丸可防治維甲酸誘導的小鼠骨質疏松，其作用機制可能與保護BMP-2及其下游調控分子BALP分泌進而促進骨形成有關。