槲皮素對低鈣高鎂飲食大鼠血清礦量和骨代謝的改善作用

鄧靜 張景嵐 周廣朋 鐘莉

四川省人民醫院，四川 成都 610072

骨質疏松癥是一種多種因素(如絕經、礦物質代謝異常、骨代謝異常等)引起的骨密度、骨質量下降性疾病[1]。骨質疏松癥患者臨床主要表現為疼痛、脊柱變形、易骨折等，疼痛可降低患者生活質量，脊柱變形可使患者活動受限，易骨折可導致患者致殘，不僅給患者生活質量帶來影響，而且也給社會、家庭和個人帶來嚴重的經濟負擔[2]。當前，骨質疏松發病機制研究主要集中于礦物質代謝異常方面，鈣攝入量不足容易導致骨質疏松癥，即低鈣骨質疏松癥[3]。鎂元素攝入量與骨質疏松癥發病的關系研究還存在爭論，但較多研究認為鎂元素攝入量過高會導致骨質疏松癥發生，同時臨床也有研究證實低鈣高鎂飲用水的鈣鎂元素交互作用也是骨質疏松癥發生的重要原因[4-5]。槲皮素是具有雌激素拮抗劑活性的雌激素類物質，其雌激素拮抗劑活性包括抗菌、抗腫瘤、抗病毒等[6]。近年來，臨床研究發現槲皮素也具有增加成骨細胞分化活性和抑制破骨細胞骨吸收的藥理作用，在維持骨代謝穩定方面可發揮功效[7]。然而槲皮素應用于鈣鎂元素交互作用骨質疏松臨床防治的研究未見報道，鑒于此，本研究以動物實驗方式觀察槲皮素對低鈣高鎂飲食大鼠血清礦量和骨代謝水平的影響，為骨質疏松臨床防治提供參考。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物：雄性SD成年黑色大鼠(供貨商：中科院生物學研究所；質量合格證號：SCXK(京)2017-0034；動物倫理審查證號：SP-DW-SMP-09-015-01)60只，鼠齡為2～4個月，平均月齡(2.08±0.24)月，體重300～330 g，平均體重(317.23±10.14) g。

1.1.2實驗藥物：槲皮素：購自上海研生實業有限公司，藥品批文：CS-0020-0807，藥品規格：50 mL/瓶，槲皮素含量200 μg/mL。

1.2 實驗方法

1.2.1適應性喂養及動物分組：動物置于符合中國實驗動物質量國家級清潔標準的實驗室中飼養，溫度設定在20 ℃～25 ℃，濕度為40%～70%，飼料為顆粒飼料(SCXK黑2018-008)，飲用水為滅菌水。均適應性喂養2周后，隨機分為空白對照組、模型對照組和槲皮素喂養組，每組各20只。

1.2.2低鈣高鎂飲食骨質疏松造模：適應性喂養2周后，模型對照組和槲皮素喂養組均進行低鈣高鎂(鈣5 mg/L，鎂60 g/L的蒸餾水溶液，由硫酸鈣、硫酸鎂、蒸餾水按比例配置)喂養3個月，參考《中國老年骨質疏松診療指南(2018)》[8]行大鼠第2腰椎QCT骨密度絕對值檢測，以骨密度絕對值<80 mg/cm3為骨質疏松造模成功標準。

1.2.3實驗喂養方法：空白對照組實驗期間正常喂養。模型對照組造模成功后正常喂養3個月。槲皮素喂養組造模期間給予槲皮素股動脈注射，給藥劑量按體重比計算槲皮素給藥量，雄性SD成年黑色大鼠體重取40只大鼠的平均體重317.23 g，成人標準給藥量為1000 μg/(kg·d)[9]，成人體重取值120 kg，計算可得成年大鼠的槲皮素標準給藥量為2.64 μg/(kg·d)。

1.3 觀察指標

1.3.1一般情況觀察：記錄整個實驗期間大鼠的日常飲食量、飲水量、體重、毛發、毛發色澤、活動等情況。

1.3.2血清礦量及骨代謝指標。分別于低鈣高鎂喂養前(實驗前)和給藥喂養3個月時(實驗后)兩個時刻點采集大鼠耳根靜脈血0.2 mL進行血清礦量及骨代謝指標測定。包括血清礦量(血鈣、血鎂、血磷)、骨吸收相關指標[Ⅰ型膠原聯蛋白羧基末端肽(CTX1)、I型膠原氨基酸延長肽(tPINP)]、骨形成相關指標[骨堿性磷酸酶(BALP)、骨鈣素(BGP)]。檢測方法：作4 000 r/min的離心處理10 min后，取上清-60 ℃保存。然后采用ELISA法測定BALP、CTX-1、tPINP的表達水平(試劑盒購自武漢博士德公司)，采用放射免疫法測定BGP水平(試劑盒購自美國Roche Diagnostic公司)，采用化學發光法測定血鈣、血鎂、血磷含量，檢測過程中嚴格按照各檢測項目試劑盒說明書操作。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 一般情況比較

實驗期間，空白對照組、模型對照組和槲皮素喂養組大鼠無死亡。空白對照組、模型對照組和槲皮素喂養組大鼠的日常飲食量、飲水量、體重等一般行為均無顯著變化，且模型對照組和槲皮素喂養組大鼠的日常飲食量、飲水量、體重比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。實驗后，空白對照組、槲皮素喂養組大鼠活動靈敏有力，毛發光潤(圖1 A、1B)，模型對照組大鼠反應較為遲鈍，毛發稍顯暗淡(圖1C)。

表1 各組大鼠實驗前后一般情況比較

圖1 實驗大鼠毛發色澤、毛質觀察 A：槲皮素喂養組；B：空白對照組；C：模型對照組Fig.1 Observation on hair color and quality of experimental rats. A: Quercetin feeding group; B: Blank control group; C: Model control group

2.2 血清礦量情況

空白對照組、模型對照組和槲皮素喂養組大鼠實驗前的血清礦量(血鈣、血鎂、血磷)比較，差異無顯著性(P>0.05)。模型對照組大鼠實驗后的血鈣量、血磷量下降，血鎂量提升，與實驗前比較，差異具有顯著性(P<0.05)。槲皮素喂養組大鼠實驗后的血鈣量、血磷量、血鎂量與實驗前比較，差異無顯著性(P>0.05)。槲皮素喂養組大鼠實驗后的血鈣量、血磷量均顯著高于模型對照組大鼠實驗后，槲皮素喂養組大鼠實驗后的血鎂量均顯著低于模型對照組大鼠實驗后，差異具有顯著性(P<0.05)。詳見表2。

2.3 骨形成指標情況

空白對照組、模型對照組和槲皮素喂養組大鼠實驗前的骨形成指標(BALP、BGP)比較，差異無顯著性(P>0.05)。模型對照組大鼠實驗后的BALP下降，BGP提升，與實驗前比較，差異具有顯著性(P<0.05)。槲皮素喂養組大鼠實驗后的骨形成指標(BALP、BGP)與實驗前比較，差異無顯著性(P>0.05)。槲皮素喂養組大鼠實驗后的BALP顯著高于模型對照組大鼠實驗后，槲皮素喂養組大鼠實驗后的BGP均顯著低于模型對照組大鼠實驗后，差異具有顯著性(P<0.05)。詳見表3。

表2 各組大鼠實驗前后血清礦量比較

表3 各組大鼠實驗前后骨形成指標比較

2.4 骨吸收指標情況

空白對照組、模型對照組和槲皮素喂養組大鼠實驗前的骨吸收指標(CTX1、tPINP)比較，差異無顯著性(P>0.05)。模型對照組大鼠實驗后的骨吸收指標(CTX1、tPINP)均提升，與實驗前比較，差異具有顯著性(P<0.05)。槲皮素喂養組大鼠實驗后的骨吸收指標(CTX1、tPINP)與實驗前比較，差異無顯著性(P>0.05)。槲皮素喂養組大鼠實驗后的骨吸收指標(CTX1、tPINP)顯著低于模型對照組大鼠實驗后，差異具有顯著性(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組大鼠實驗前后骨吸收指標比較

3 討論

據估計，我國骨質疏松癥人群高達1億人以上，占比已經達總人口的7%以上，且占比呈逐年增長的趨勢，同時隨著人口老齡化，骨質疏松癥發病越來越多，使骨質疏松癥防治成為當代醫學的研究熱點[10]。骨質疏松癥發生的根本原因在于骨吸收和骨形成功能失衡。目前學術界普遍認為骨質疏松癥發病機制包括4個方面：雌激素分泌異常、骨鈣缺乏、系統性骨激素調控異常和遺傳受體異常，其中骨鈣缺乏是骨質疏松癥發生的最主要原因[11]。臨床大劑量補充鈣元素可導致機體軟骨組織嚴重鈣化，臨床有補充鎂元素替代補充鈣元素治療骨質疏松癥，且證實確有實效，這引發了鎂元素與骨質疏松癥發生的關系方面研究的開端[12]。鎂元素可通過荷爾蒙及其他調節因子間接對機體骨組織代謝產生影響，可促進機體骨形成，有研究顯示無論補鈣多少，若不聯合補充鎂元素，仍會產生骨質疏松癥[13]。我國學者譚瑤[14]和外國學者Lucia等[15]均報道了本地區低鈣高鎂飲用水使本地區骨質疏松癥發病率高于其他地區，可見鎂、鈣元素的交互作用可提升骨質疏松癥的發病率。本研究以低鈣高鎂飲食建立了鈣鎂交互作用骨質疏松癥大鼠模型，從模型構建結果來看，大鼠骨密度值達到了低于80 mg/cm3的要求，同時模型對照組大鼠實驗后的血鈣量、血磷量、BALP均下降，血鎂量、BGP、CTX1、tPINP均提升，與實驗前比較差異顯著(P<0.05)。可見模型構建較為成功，且也證實了鈣鎂交互作用可誘導骨質疏松癥發生。

本研究觀察了槲皮素對低鈣高鎂飲食骨質疏松癥大鼠的生長、血清礦量、骨代謝水平的影響。SD大鼠一般于出生10周齡(2.5個月左右)后性器官發育成熟，3個月后骨骼發育成熟，在此期間SD大鼠可進入成年期，成年期SD大鼠生長發育受遺傳和環境因素影響較小，因此可采取營養補給方式對大鼠生長進行干預[16]。本研究采用雄性SD成年大鼠進行研究，可避免遺傳和環境因素對生長發育的影響。本研究顯示，與適應性喂養期間比較，實驗期間模型對照組和槲皮素喂養組大鼠的日常飲食量、飲水量、體重等一般行為均無顯著變化，且模型對照組和槲皮素喂養組大鼠的日常飲食量、飲水量、體重比較無差異性，雖然槲皮素喂養組實驗大鼠更具活力，毛發更光潤，但可以認為槲皮素對低鈣高鎂飲食大鼠的生長基本無影響。血鈣、血鎂、血磷均是與機體骨代謝相關的重要礦物質，可在骨質疏松癥發生發展中起到重要作用。本研究結果顯示，槲皮素喂養組大鼠實驗后的血鈣量、血磷量均顯著高于模型對照組大鼠實驗后，槲皮素喂養組大鼠實驗后的血鎂量均顯著低于模型對照組大鼠實驗后，提示槲皮素對低鈣高鎂飲食大鼠異常血清礦量有改善作用。血鈣、血鎂、血磷等形成的血清礦物質調節系統是一個互相聯系、互相制約的整體，當血鈣、血磷含量下降和血鎂含量上升時，會導致機體甲狀旁腺激素分泌增加，促進1α-醇化酶活性和25(OH)2D3的合成[17]。25(OH)2D3不但可抑制骨代謝相關鈣結合蛋白生成，而且會抑制骨代謝水平[18]。結合本研究槲皮素對低鈣高鎂飲食大鼠異常血清礦量的改善作用，提示槲皮素可起到防治骨質疏松癥的作用。在骨質疏松癥發生過程中，骨代謝水平的作用明顯，其中主要起作用包括骨吸收相關指標、骨形成相關指標等，但具體作用機制當前并無確切定論。王華林等[19]認為骨形成指標BALP和BGP可反映成骨細胞成熟度和物理活性，是骨形成功能的表型標志物，BALP下調或BGP上調均可導致骨質疏松癥的發生。Akatau等[20]認為骨吸收指標CTX-1、tPINP上調均可導致骨密度下降，最終引發骨質疏松癥。在本研究中，槲皮素喂養組大鼠實驗后的血鈣量、血磷量、BALP均顯著高于模型對照組大鼠實驗后(P<0.05)，但與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；槲皮素喂養組大鼠實驗后的血鎂量、BGP、CTX1、tPINP均顯著低于模型對照組大鼠實驗后(P<0.05)。研究結果提示槲皮素可對低鈣高鎂飲食大鼠異常骨代謝水平有改善作用，可能原因在于槲皮素具有增加成骨細胞分化活性和可抑制破骨細胞骨吸收的功效，使槲皮素喂養組大鼠的骨吸收和骨形成保持動態平衡[21-22]。結合槲皮素對低鈣高鎂飲食大鼠異常骨代謝的改善作用，提示槲皮素可起到預防骨質疏松癥的作用。

綜上所述，鎂、鈣元素的交互作用可誘導骨質疏松癥發生，槲皮素可顯著改善低鈣高鎂飲食大鼠血清礦量和骨代謝水平，可能在低鈣高鎂交互作用誘導骨質疏松癥的預防中起到重要作用。但本研究僅為動物實驗，將槲皮素應用于骨質疏松癥臨床預防，仍需要前瞻性研究的證實。