加熱因素對靈芝含片總多糖含量測定的影響性研究

胡文軍，何怡靜，李孝棟

(福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122)

靈芝作為傳統中藥，具有補氣安神、扶正固本、止咳平喘的功效[1]?，F代研究表明，靈芝可改善老年免疫功能低下，拮抗氧化應激所致的組織損傷，抑制阿爾茨海默病(AD)的發生和發展[2]，已經被廣泛用作中老年人群的養生保健產品。靈芝多糖是靈芝的主要生物活性成分之一[3]，具有廣泛的藥理活性，有提高機體免疫力、抑制腫瘤、增強機體耐氧能力、抗衰老、抗輻射、降血糖等功效[4-6]。

目前，靈芝的藥物制劑主要有孢子粉、膠囊、滴丸、普通片劑等[7-9]，有關靈芝含片的開發研究還比較少。含片是含在口腔內緩緩溶解而發揮局部或全身治療作用的片劑，在口腔內停留時間長，具有身心愉悅下發揮功效的特點。

硫酸苯酚比色法測定多糖含量的原理是多糖或寡糖被濃硫酸在高溫下水解，產生單糖并迅速脫水成糠醛衍生物，該衍生物在強酸條件下與苯酚起顯色反應，生成橙黃色物質，在490 nm處測定多糖含量[10]。但硫酸苯酚法實際測試中，有文獻[11-12]選擇直接冷卻操作后測定吸光度，因為加入濃硫酸時產生放熱現象，形成的高溫溶液，可以使多糖水解進而完成顯色反應，更多文獻[13-15]則是加熱一定時間后再冷卻，繼而測定吸光度，該方法使多糖在穩定高溫下的水解更充分，進而與苯酚再產生顯色反應。多糖在加熱條件下水解反應式見圖1。

圖1 多糖在加熱條件下水解反應式

本試驗擬對加熱因素進行考察，研究其對靈芝含片總多糖含量的影響，以期找到測定總多糖的最佳方法，為其質量標準的合理制訂提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器 UV-9600紫外分光光度計(北京北分瑞利分析儀器)；MS105DU電子天平(梅特勒-托利多儀器)；TDL80-2B離心機(上海安亭科學儀器廠制造)；HH-S型水浴鍋(鄭州長城科工貿有限公司)。

1.2 試藥 靈芝含片(福建中醫藥大學中藥藥劑實驗室自制，批號：20180928、20180929、20180930)；苯酚(西隴科學股份有限公司)；硫酸(西隴科學股份有限公司)；葡聚糖(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；無水乙醇(西隴科學股份有限公司)。

2 方法與結果

2.1 試藥的制備

2.1.1 多糖樣品的制備 取制備的靈芝含片適量，研細，精密稱取7.0 g置于250 mL燒杯中，加入16倍量蒸餾水，浸泡15 min，100 ℃水浴加熱30 min，將提取液在3 000 r·min-1離心10 min，取上清液加入乙醇適量配成含乙醇60%的溶液，靜置1 h后將溶液分裝于離心管中，于3 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液干燥沉淀后得多糖樣品156.46 mg。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取2.5 mg葡聚糖對照品置于25 mL容量瓶內，加蒸餾水溶解并定容至刻度。

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系考察 分別精密吸取葡聚糖對照品溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL于具塞試管內，加水補至2.0 mL，得到系列濃度梯度的對照品溶液。分別精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，緩慢精密加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，直接冷卻，以蒸餾水同步操作作為空白參比，在490 nm處測定吸光度值，以濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，建立線性方程，其線性方程為Y=0.014 6X-0.016 7，r=0.997 8。再按以上步驟進行操作，直接冷卻改為沸水浴加熱后冷卻，其線性方程為Y=0.013 8X-0.033 5，r=0.997 7，結果表明，對照品溶液在15～50 μg·mL-1濃度范圍內，線性關系良好(見圖2)。

A.直接冷卻;B.加熱后冷卻圖2 標準曲線

2.2.2 精密度試驗 精密吸取0.7 mL 葡聚糖對照品溶液，加水至2.0 mL，按“2.2.1”項下操作連續測定6次，直接冷卻和加熱后冷卻操作下測得吸光度值的RSD分別為0.10%和0.11%，說明儀器的精密度良好,結果見表1。

表1 精密度試驗 (n=6)

2.2.3 重復性試驗 精密稱取1.0 mg “2.1.1”項下多糖樣品6份(批號：20180928)，置于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，得供試品溶液。分別精密吸取0.6 mL，補水至2.0 mL，按照“2.2.1”項下操作測定吸光度值。直接冷卻和加熱后冷卻操作下測得多糖含量的RSD分別為3.21%和2.87%，說明該方法重復性良好，結果見表2。

表2 重復性試驗(n=6)

2.2.4 穩定性試驗 取“2.2.3”項下制備的供試品溶液，在制備后0、20、40、60、80、100、120 min測定吸光度值，考察其在2 h內的穩定性。直接冷卻和加熱后冷卻操作下測得吸光度值的RSD分別為0.37%和0.27%，說明在兩種操作下制備的供試品溶液在2 h內均穩定，結果見表3。

表3 穩定性試驗

2.2.5 加樣回收率試驗 精密稱取6份已知含量的多糖樣品，分別精密加入等量葡聚糖對照品，置于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，再分別精密吸取0.6 mL，加水補至2.0 mL，按照“2.2.1”項下操作測定吸光度值，計算加樣回收率。經測定，直接冷卻和加熱后冷卻操作下測得的平均加樣回收率分別為98.47%和98.32%，RSD分別為2.70%和1.78%，說明該方法回收率較高，結果見表4。

表4 加樣回收率試驗(n=6)

2.2.6 含量測定 取3批靈芝含片適量，分別按“2.1.1”項下操作，平行制備3份，置于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，分別精密吸取0.6 mL，補水至2.0 mL，按照“2.2.1”項下操作測定吸光度值，代入線性回歸方程計算靈芝含片中總多糖含量。測得靈芝含片中總多糖含量見表5。

表5 靈芝含片中總多糖的含量(n=3)

3 討論

本試驗先取一定量的靈芝含片，將其中的多糖提取出來，然后用于方法學考察和含量測定，簡化了試驗操作步驟，避免了因取樣量太少而無法得到沉淀多糖的現象。選取葡聚糖為對照品，是因為靈芝多糖結構主要為β-糖苷鍵連接的吡喃型葡聚糖[5]。在靈芝含片總多糖的含量測定的方法學考察中，經查閱文獻[16-18]，線性關系考察中的濃度大多從“加至2 mL”開始算起，后加的5%苯酚溶液和濃硫酸體積不算在內，所以本試驗選擇從“加至2 mL”開始計算其濃度并對線性關系進行考察。在試驗中要保證操作的一致性，比如進行加熱后冷卻操作時應保證在沸水浴中同時加熱30 min等。