氣相色譜—串聯質譜結合固相萃取技術同時測定番茄和黃瓜中10種殺菌劑

張 瑤 吳龍國 馬桂娟 龔 慧 高 琳 孫 謙

(1. 寧夏食品檢測研究院，寧夏 銀川 750021；2. 寧夏大學，寧夏 銀川 750021； 3. 島津企業管理〔中國〕有限公司，陜西 西安 710032)

蔬菜作為人們日常飲食中不可或缺的食物之一，主要為機體提供所需的維生素、礦物質、纖維等營養物質，以滿足機體正常的新陳代謝。而在蔬菜種植過程中會發生各種各樣的病蟲害，種植者常常會使用農藥殺菌劑進行防治，避免蔬菜進一步受到病蟲害的侵染，這就很容易造成殺菌劑在蔬菜中的殘留問題，對人體身體健康存在潛在的危害。

目前，中國蔬菜作物上登記的殺菌劑成分150種，不同成分登記的殺菌劑產品達220種[1]。最新發布的《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》，新增了51種農藥、2 967項農藥最大殘留量限量標準[2]。中國學者針對殺菌劑在水果[3-7]、蔬菜[8-13]以及土壤[14-15]中的殘留做了大量的研究，結果表明在農產品中殺菌劑殘留檢出率較高，尤其番茄和黃瓜中常見的啶氧菌酯、E-苯氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌酯、氟嘧菌酯、吡唑醚菌酯、嘧菌酯10種殺菌劑殘留尤為突出。

隨著現代分析化學技術的提高，農藥殘留檢測也有了迅速的發展，農藥殘留檢測主要采用氣相色譜串聯質譜法[16-17]、液相色譜—串聯質譜法[18-20]等。液相色譜法和氣相色譜質譜聯用法容易受到基質的干擾，耗時耗力、檢測效率低，不能滿足目前殺菌劑種類不斷增加、分析通量相應提高的需求。由于固相萃取(Solid Phase Extraction，SPE)通過選擇性吸附、選擇性洗脫的方式對樣品進行富集、分離、純化，可同時完成樣品富集與凈化，大大提高了檢測靈敏度。因此，試驗擬采用氣相色譜—串聯質譜法結合固相萃取技術對番茄和黃瓜中殺菌劑殘留的檢測進行研究，旨在為監測其他蔬菜中的農藥殘留提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

啶氧菌酯、E-苯氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌酯、氟嘧菌酯、吡唑醚菌酯、嘧菌酯標準品：純度>99%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；

甲苯、丙酮、環己烷、正己烷、乙酸乙酯：色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；

氯化鈉：優級純，國藥集團化學試劑有限公司；

乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)：色譜純，美國安捷倫公司。

1.1.2 主要儀器設備

三重四極桿氣相色譜質譜聯用儀：GCMS-TQ 8040型，島津企業管理(中國)有限公司；

數顯型分散機：IKAT25型，德國IKA公司；

旋轉蒸發儀：BUCHI V-850型，瑞士步琦實驗室公司；

全自動凝膠凈化系統：GPC1000型，北京萊伯泰科儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制 將啶氧菌酯、E-苯氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌酯、氟嘧菌酯、吡唑醚菌酯、嘧菌酯的標準品用甲苯配制成1.0 mg/mL的殺菌劑標準溶液。再根據試驗所需配置成一定濃度的標準溶液。

1.2.2 樣品前處理 分別稱取15.00 g制備好的番茄和黃瓜蔬菜混勻的試樣于50 mL塑料離心管中，加入5 g氯化鈉，加入15 mL乙腈溶液，先10 000 r/min高速勻漿2 min，再以4 000 r/min離心6 min，轉移上清液于梨形瓶中，加入30 mL乙腈，重復提取1次，合并2次上清液，40 ℃濃縮至近干，用2 mL環己烷—乙酸乙酯溶解雞心瓶中殘留物。

1.2.3 SPE凈化 將1.2.2中溶解液過固相萃取柱，以乙酸乙酯/環己烷為洗脫液，收集洗脫液，40 ℃旋蒸，用2 mL 乙酸乙酯/環己烷定容，加入PSA，混勻，0.22 μm濾膜過濾，供GC-MS/MS測定。

1.2.4 GPC凈化 將1.2.2中溶解液置于GPC樣品瓶中，采用GPC進行凈化，環己烷乙酸乙酯作為流動相，設置參數：進樣體積2 mL，流速4 mL/min，在波長254 nm下進行檢測。在第11～19 min內收集洗脫液至雞心瓶中，40 ℃旋蒸，用2 mL乙酸乙酯/環己烷定容，加入PSA，混勻，0.22 μm濾膜過濾，供GC-MS/MS測定。

1.3 儀器條件

色譜柱：HP-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱溫程序：初設溫度160 ℃，保持1 min；以15 ℃/min升至280 ℃，保持2 min；再以10 ℃/min升溫至300 ℃，保持10 min。流速：1.4 mL/min；進樣量：1 μL；進樣方式：不分流進樣；載氣：氦氣，純度≥99.999%；進樣口溫度：300 ℃；流速控制方式：恒線速度方式；柱流量：1.2 mL/min；進樣方式：不分流進樣；高壓進樣：250 kPa(1 min)；離子化方式：EI；離子源溫度：230 ℃；色譜質譜接口溫度：280 ℃；檢測器電壓：調諧電壓+0.6 kV；采集模式：MRM；啶氧菌酯、E-苯氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌酯、氟嘧菌酯、吡唑醚菌酯、嘧菌酯的離子對及保留時間信息見表1。

1. 啶氧菌酯 2. E-苯氧菌酯 3. 醚菌酯 4. 嘧螨酯 5. 肟菌酯 6. 醚菌胺 7. 肟醚菌酯 8. 氟嘧菌酯 9. 吡唑醚菌酯 10. 嘧菌酯

表1 化合物名稱、保留時間及選擇離子

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化

在SCAN掃描模式下，將10種殺菌劑(啶氧菌酯、E-苯氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌酯、氟嘧菌酯、吡唑醚菌酯、嘧菌酯)目標化合物進行全掃描，獲得各個物質的保留時間以及質荷比較大、豐度較高的特征性一級碎片離子。利用EI源采用不同能量值轟擊母離子，得到不同能量下的二級質譜圖。選擇豐度較高、質荷比較大、特征性強的離子以確定最優的碰撞能量，在此能量值合適范圍內做進一步優化，獲取最佳碰撞能量，得到100 μg/L質量濃度的10種殺菌劑標準溶液色譜圖，如圖1所示。

2.2 前處理條件優化

2.2.1 提取試劑的選擇 因啶氧菌酯、E-苯氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌酯、氟嘧菌酯、吡唑醚菌酯、嘧菌酯10種殺菌劑屬于不同結構的化合物，但易溶于甲苯、乙腈等有機試劑，而且以乙腈作為提取溶劑，可以減少雜質干擾，同時沉淀蛋白質，使提取率更高，提高待測組分的回收率。

相比采用乙酸乙酯/正己烷(1∶1)，正己烷/丙酮(4∶6)，采用乙腈作為提取試劑對 10種殺菌劑的回收率范圍較合適，主要是因為乙酸乙酯/正己烷(1∶1)與正己烷/丙酮(4∶6)作提取劑時，提取的色素等雜質較多，不宜凈化，對待測目標物的干擾較大。

2.2.2 提取方式的選擇 對比了勻漿、超聲、振蕩3種提取方式：均質提取2 min、超聲提取20 min和震蕩提取30 min。經試驗證明，超聲和振蕩對樣品的粉碎程度要求較高，且回收率偏低。勻漿提取，花費時間較短，樣品均勻分散，且經過兩次反復提取，回收率較高。

2.2.3 凈化方式的選擇 對比分析了石墨氨基柱、GPC以及氨基柱的固相萃取凈化方式對除去色素干擾的效果。試驗結果表明：10種甲氧基丙烯酸酯類化合物經石墨氨基柱凈化后，除氟嘧菌酯回收率低于30%，剩余物質均介于83.6%～117.9%，主要是源于石墨化炭黑對平面結構的農藥有一定的吸附作用。氟嘧菌酯分子結構中含氯苯氧基和苯基以及六元雜環，容易被吸附，因此，難以從石墨氨基凈化柱上洗脫。采用GPC凈化時，由于不同基質對吸收波長下樣品接收存在不同程度的干擾，容易造成回收率偏高，且對試劑的消耗量較大，雖凈化效果較好，但不適合大批量、多種復雜基質的檢測。而采用氨基柱，10種物質在番茄中的回收率范圍均為84.7%～117.0%，回收范圍較好，且方便快捷，可應用于不同基質的大批量樣品的同時檢測分析。因此，最終選擇氨基柱進行凈化。

2.2.4 基質效應 由于基質效應的存在，容易得到假陽性或假陰性的錯誤檢測結果，并對待測樣的準確定量造成嚴重干擾[15]。為了避免基質效應的影響，同時提高待測樣品的檢測準確度，采用不含殺菌劑的提取液作為空白基質，繪制標準曲線，從而降低基質對測定結果的影響。為了對比不同殺菌劑的基質效應，按式(1)求得10種殺菌劑的基質效應。10種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑在番茄和黃瓜中的基質效應如圖2所示。

圖2 10種殺菌劑在黃瓜和番茄中的基質效應

ME=Km/Ks，

(1)

式中：

ME——基質效應；

Km——基質標準曲線的斜率；

Ks——溶劑標準曲線的斜率。

2.2.5 標準曲線、線性范圍及檢出限 為降低基質中的干擾物質對目標化合物產生基質效應，分別提取了不含殺菌劑的番茄與黃瓜提取液作為空白基質液。用空白基質提取液將混合標準溶液稀釋成相應濃度的標準曲線，然后進行測定。10種殺菌劑的線性回歸方程、相關系數、線性范圍及檢出限(信噪比S/N≥3)見表2。結果表明，10種殺菌劑在基質中相關系數均達到0.999 1以上。

表2 相關系數及靈敏度測試結果

2.3 回收率和重現性

通過回收試驗，測定方法的準確度和精密度(n=6)，

添加回收率試驗結果見表3。取不含待測成分的空白樣品在0.05，0.01 mg/kg的濃度水平上進行加標回收試驗，每個水平重復6次，按照試驗方法對樣品進行提取、凈化，測得番茄、黃瓜中的加標回收率及相對標準偏差(RSD)如表3所示。

表3 番茄和黃瓜中10種殺菌劑的平均回收率和相對標準偏差

2.4 實際樣品的檢測

隨機抽取檢測市場上購買的蔬菜樣品19份，其中嘧菌酯、吡唑醚菌酯、醚菌酯、肟菌酯、啶氧菌酯的檢出率分別是28.1%，15.6%，12.5%，6.2%，3.1%，其余均為未檢出。

3 結論

試驗采用氣相色譜—串聯質譜結合固相萃取技術，對蔬菜中啶氧菌酯、E-苯氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、肟菌酯、醚菌胺、肟醚菌酯、氟嘧菌酯、吡唑醚菌酯、嘧菌酯10種殺菌劑殘留進行了測定。結果顯示，10種殺菌劑藥在1.0～200.0 μg/L的質量濃度范圍內，具有良好的線性關系，相關系數均>0.999 1，方法檢出限為0.1～0.5 μg/kg。實際樣品加標回收率為84.7%～117.0%，相對標準偏差(n=6)為0.4%～4.7%。結果表明，采用高效氣相色譜—串聯質譜法結合固相萃取技術的試驗方法凈化效果較好，穩定準確，靈敏度高。后續將擴大檢測樣品的類型和數量，不斷去驗證該方法的穩定性。