赤小豆凝集素的分離純化及電泳分析

肖俊琪 翟愛(ài)華,2,3 張東杰,2,3

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319;2. 黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 大慶 163319;3. 國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319)

赤小豆[Vignaumbellata(Thunb.)Ohwi and Ohashi]是亞洲豇豆屬中的罕見(jiàn)亞種，由于具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特的藥用價(jià)值在中國(guó)被廣泛食用[1]。其蛋白質(zhì)含量為22%，脂肪含量為0.3%，碳水化合物含量為65%[2]，還含有一定的兒茶素、表兒茶素、槲皮素-3’-O-ɑ-L-鼠李糖苷和(±)二氫槲皮素等活性物質(zhì)[3]。赤小豆可用于治療慢性復(fù)發(fā)皮膚炎、小兒急性腎小球腎炎和一些慢性皮膚病[4]，并具有重要的營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)功能[5]和藥用價(jià)值[6-7]。

目前，已發(fā)現(xiàn)的凝集素有57 000余種，其中豆科凝集素有1 600多種，且有近400種凝集素具有3D構(gòu)象[8]。凝集素是一類能結(jié)合糖結(jié)構(gòu)域的非免疫性糖蛋白或碳水化合物結(jié)合蛋白[9]，可用于凝集素—捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Lectin-Capture ELISA)中快速捕獲和定量樣品中的HCV E1E2抗體[10]；在病原體感染的先天免疫應(yīng)答中起重要作用并具有潛在的免疫調(diào)節(jié)活性[11]；凝集素還具有抗生物膜特性和抑菌特性，可成為治療疾病的潛在工具[12]。凝集素由于能特異性識(shí)別血細(xì)胞而被應(yīng)用于血型檢測(cè)中[13-14]。試驗(yàn)擬對(duì)赤小豆凝集素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以凝集活性為指標(biāo)評(píng)價(jià)其分離純化效果。通過(guò)SDS-PAGE電泳、Q Sepharose XL陰離子交換色譜、Phenyl FF HP疏水層析色譜和Sephadex G-50凝膠過(guò)濾色譜技術(shù)進(jìn)行純化，旨在為提高赤小豆種質(zhì)資源優(yōu)勢(shì)和豆科凝集素的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料來(lái)源

赤小豆：大慶瑞澤豐農(nóng)業(yè)技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器與試劑

超微量分光光度計(jì)：NanoDrop 2000c型，美國(guó)賽默飛世爾公司；

超純水儀器：Thermo Scientific Barnstead GenPure型，美國(guó)賽默飛世爾公司；

小型垂直電泳槽：BIO-RAD MINI 4型，美國(guó)伯樂(lè)Bio-rad公司；

冷凍干燥機(jī)：Alpha 1-2 LD plus型，德國(guó)CHRISTA公司；

PBS磷酸鹽緩沖溶液、PB磷酸鹽緩沖液、硫酸銨、氯化鈉：分析純，中國(guó)Biosharp公司；

瓊脂糖凝膠、苯基瓊脂糖凝膠：分析純，瑞典烏普薩拉公司；

交聯(lián)葡聚糖凝膠：分析純，美國(guó)通用電氣公司；

電泳試劑：分析純，美國(guó)Bio-Rad生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取條件優(yōu)化

(1) 浸提液種類：料液比1∶15 (g/mL)，pH 7.5，提取時(shí)間12 h，考察浸提液種類(ddH2O、0.01 mol/L PB、0.01 mol/L Tris-HCl、0.01 mol/L生理鹽水、0.01 mol/L PBS)對(duì)凝集活性的影響。

(2) 料液比：以PBS為浸提液，pH 7.5，提取時(shí)間12 h，考察料液比[1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 (g/mL)]對(duì)凝集活性的影響。

(3) pH：以PBS為浸提液，料液比1∶20 (g/mL)，提取時(shí)間12 h，考察pH (6.0，6.5，7.0，7.5，8.0)對(duì)凝集活性的影響。

(4) 浸提時(shí)間：以PBS為浸提液，料液比1∶20 (g/mL)，pH 7.5，考察浸提時(shí)間(4，8，12，16，20 h)對(duì)凝集活性的影響。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比、pH和提取時(shí)間為試驗(yàn)因素，以凝集活性為響應(yīng)值，運(yùn)用Design Expert 8.0設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。

1.2.3 硫酸銨分級(jí)沉淀 根據(jù)文獻(xiàn)[15-16]修改如下：向粗提液中加入飽和硫酸銨溶液，分別調(diào)節(jié)飽和硫酸銨濃度至35%，40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%。4 ℃靜置4 h，11 000 r/min離心10 min，分別收集沉淀和上清液。不同飽和濃度下的沉淀物以ddH2O復(fù)溶，并充分透析(14 kDa，36 mm)，測(cè)定復(fù)溶液凝集活性，選取硫酸銨分級(jí)沉淀范圍。

1.2.4 凝集活性測(cè)定 參照Park等[17]的方法。按式(1) 計(jì)算凝集活性。

(1)

式中：

Y——凝集活性，HU；

n——凝集孔的最大數(shù)量；

C——蛋白濃度，mg/mL；

V——樣品體積，μL。

1.2.5 丙烯酰胺凝膠電泳 根據(jù)文獻(xiàn)[18-19]修改如下：凝膠以5 mg/100 mL堆疊在上層，下部凝膠為12 mg/100 mL；起始電壓80 V，保持15 min；分離標(biāo)記后將電壓調(diào)至120 V，連續(xù)運(yùn)行30 min；用考馬斯亮藍(lán)R-250振蕩染色15 min；使用5 mL/100 mL乙醇和10 mL/100 mL 乙酸混合溶液脫色。

1.2.6 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 使用NanoDrop 2000C測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，PBS溶液為空白組，選取2 μL樣品。

1.2.7 離子交換色譜 緩沖溶液A(20 mmol/L Tris-HCl pH 7.8)溶解樣品，用預(yù)平衡的陰離子交換柱Q Sepharose XL(Q XL 1 mL)和緩沖溶液B(1 mol/L NaCl+20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8) 對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行梯度洗脫(0%～100%)，流速0.5 mL/min，洗脫體積20 mL。收集洗脫組分用于凝血活性檢測(cè)和SDS-PAGE分析。

1.2.8 疏水層析色譜 緩沖溶液C(2.4 mol/L (NH4)2SO4+20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8)用于平衡色譜柱Phenyl FF HP(HiTrapTM1 mL)，緩沖溶液A(20 mmol/L Tris-HCl)梯度洗脫柱上蛋白質(zhì)(0%～100%)，流速0.5 mL/min，洗脫體積20 mL。收集洗脫組分用于凝血活性檢測(cè)和聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分析。

1.2.9 凝膠過(guò)濾色譜 將富集的組分加載到已用緩沖溶液A(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8)平衡的Sephadex G-50凝膠過(guò)濾層析柱上，流速0.5 mL/min。收集洗脫組分用于凝血活性檢測(cè)和SDS-PAGE分析。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理 運(yùn)用Origin 8.0、SPSS 19.0、MaxQuant 1.6.1.0、PrimeView 5.0和Design Expert 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和數(shù)據(jù)圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 浸提液對(duì)凝集素提取效果的影響 由圖1可知，生理鹽水組和PBS組的凝集活性明顯高于其他組，其中PBS組的更高，可能與PBS緩沖液具有較強(qiáng)的緩沖作用有關(guān)，能更好地維持凝集素的結(jié)構(gòu)和活性，與蘇艷玲等[20]的研究結(jié)果一致。因此，PBS溶劑為赤小豆凝集素的最優(yōu)提取劑。

圖1 浸提液種類對(duì)凝集素提取效果的影響

2.1.2 料液比對(duì)凝集素提取效果的影響 由圖2可知，凝集活性隨料液比的增加呈先增加后降低趨勢(shì)。隨著料液比的增加，可溶性蛋白傳質(zhì)動(dòng)力增加，蛋白質(zhì)溶解度增大[21]；當(dāng)可溶性蛋白濃度達(dá)最大值后，料液比的增加反而會(huì)使蛋白質(zhì)濃度降低[22]。故選擇料液比為1∶20 (g/mL)進(jìn)行赤小豆凝集素粗提取。

圖2 料液比對(duì)凝集素提取效果的影響

2.1.3 pH對(duì)凝集素提取效果的影響 凝集素具有兩性解離性質(zhì)，溶液pH與蛋白等電點(diǎn)會(huì)影響凝集活性[23]。豆科植物凝集素等電點(diǎn)多為5.4～6.5，當(dāng)提取劑pH接近赤小豆凝集素等電點(diǎn)時(shí)，凝集素聚沉凝集活性降低，偏離等電點(diǎn)后凝集素逐漸溶解，凝集活性增大[24]。由圖3可知，當(dāng)pH為 6.0～6.5時(shí)，凝集活性較低且變化不明顯，當(dāng)pH值繼續(xù)增大至偏離凝集素等電點(diǎn)時(shí)，凝集素逐漸溶解，凝集活性逐漸上升，并在pH 7.5附近達(dá)最大值。因此，選擇pH 7.5作為赤小豆凝集素浸提液的最佳pH值。

圖3 pH對(duì)凝集素提取效果的影響

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)凝集素提取效果的影響 由圖4可知，凝集活性隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)浸提時(shí)間為16 h時(shí)，凝集活性達(dá)到峰值(35.10 HU)，說(shuō)明提取時(shí)間的適當(dāng)延長(zhǎng)有利于赤小豆凝集素的提取。因此，選擇16 h作為赤小豆凝集素提取的最優(yōu)浸提時(shí)間。

圖4 浸提時(shí)間對(duì)凝集素提取效果的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以凝集活性為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken中心組合原理進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面因素水平表

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 使用Design Expert 8.0軟件對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得凝集活性(Y)的二次多項(xiàng)式回歸方程：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

Y=34.91+2.99X1+6.13X2-3.72X3-0.85X1X2+1.51X1X3-6.19X2X3-1.44X12-8.84X22-5.38X32。

(2)

表3 二次模型的方差分析?

2.2.3 交互作用分析與驗(yàn)證 由圖5可知，料液比與pH之間對(duì)凝集活性的影響不顯著、料液比與浸提時(shí)間之間對(duì)凝集活性的影響顯著、pH與浸提時(shí)間之間對(duì)凝集活性的影響極顯著，說(shuō)明各因素間的交互作用極顯著，與方差分析結(jié)果一致。該模型得到的凝集素最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶22.96 (g/mL)，pH 7.76，浸提時(shí)間13.77 h，該條件下凝集活性預(yù)測(cè)值為38.08 HU。結(jié)合實(shí)際，將各因素修正為料液比1∶23 (g/mL)，pH 7.8，浸提時(shí)間14 h，實(shí)測(cè)凝集活性為(37.18±0.18) HU (n=3)，與預(yù)測(cè)值接近，表明優(yōu)化的工藝條件可靠，方程擬合良好，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

圖5 各因素交互作用響應(yīng)面曲面圖

2.3 硫酸銨分級(jí)沉淀

由表4可知，當(dāng)混合液中硫酸銨飽和度提高到45%時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)凝集活性(0.06 HU)，且隨混合液中硫酸銨飽和度的增加出現(xiàn)兩個(gè)凝集活性增加區(qū)間(45%～65%和70%～85%)，直至混合液中硫酸銨飽和度為85%時(shí)達(dá)到最大(178.32 HU)；當(dāng)混合液中硫酸銨飽和度由65%增加至70%時(shí)，凝集活性下降(17.44 HU)，說(shuō)明在此分級(jí)區(qū)間內(nèi)有更多雜蛋白被沉淀出來(lái)；為保證凝集素含量并減少試劑用量，選擇赤小豆凝集素的硫酸銨分級(jí)沉淀范圍為45%～80%。

表4 硫酸銨分級(jí)沉淀結(jié)果

2.4 離子交換色譜

由圖6可知，相比于DEAE填料，Q Sepharose XL填料具有更好的分離效果。經(jīng)Q Sepharose XL層析分離出具有凝集活性的組分F1和F2，其中組分F2的凝集活性更高，而F3未觀察到凝集現(xiàn)象。因此，收集組分F1和F2的峰部分，富集后用于疏水層析色譜進(jìn)一步分析。

圖6 離子交換色譜

2.5 疏水層析色譜

由圖7可知，經(jīng)疏水層析梯度洗脫分離出了兩個(gè)具有凝集活性的組分F4和F5，其峰型變化趨勢(shì)與凝集活性變化趨勢(shì)相同，說(shuō)明組分F4與F5中可能存在兩種具有不同疏水性質(zhì)的凝集素。凝集素種類的多樣性可能是表4 中出現(xiàn)兩個(gè)凝集活性增加區(qū)間的原因。對(duì)比SDS-PAGE電泳，組分F5中的蛋白組成更為復(fù)雜，因此重復(fù)提取并富集組分F4中的第15管用于進(jìn)一步分析。

圖7 疏水層析色譜

2.6 凝膠過(guò)濾色譜

由圖8可知，經(jīng)凝膠過(guò)濾色譜分離出了具有高凝集活性(127 HU)的組分F6。目標(biāo)蛋白在SDS-PAGE電泳中顯示2條電泳條帶，分子量在55 kDa和27 kDa附近，與Pradip等[25]的研究結(jié)果相似。SDS-PAGE電泳中，十二烷基硫酸鈉通過(guò)斷裂凝集素與其他分子間的非共價(jià)鍵使蛋白分子去折疊，強(qiáng)還原劑(巰基乙醇)能通過(guò)斷裂半胱氨酸殘基間的二硫鍵(S—S)使凝集素分子解聚成多肽鏈[26]。因此，凝膠過(guò)濾色譜的單一峰型表明目標(biāo)蛋白純化水平較高，并且在溶液中以穩(wěn)定的多聚體形式存在[27]；結(jié)合SDS-PAGE凝膠電泳和凝集活性可以說(shuō)明，純化的蛋白是單體蛋白，在具有強(qiáng)還原劑條件下，蛋白中的二硫鍵斷裂解聚為兩條亞基并且該亞基具有凝集活性。純化結(jié)果表明，赤小豆凝集素的兩條亞基分子量為55 kDa和27 kDa左右。

圖8 凝膠過(guò)濾層析色譜

3 結(jié)論

以赤小豆為原料提取凝集素，利用單因素結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)得到赤小豆凝集素的最優(yōu)粗提條件為：以PBS磷酸鹽緩沖液為浸提劑，料液比1∶23 (g/mL)，pH 7.8，浸提時(shí)間14 h；粗提物經(jīng)65%～80%飽和硫酸銨分級(jí)沉淀、Q Sepharose XL陰離子交換層析、phenyl FF HP疏水層析、Sephadex G-50凝膠過(guò)濾層析后獲得赤小豆凝集素。其中，Q Sepharose XL陰離子層析填料比DEAE陰離子層析填料更適合赤小豆凝集素的初步分離；聚丙烯酰胺凝膠電泳表明，赤小豆凝集素的兩條亞基分子量分別在55 kDa和27 kDa附近。后續(xù)還需從以下幾個(gè)方面開(kāi)展研究：① 通過(guò)液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜方法對(duì)赤小豆凝集素進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定；② 探究赤小豆凝集素基礎(chǔ)理化特性，如金屬離子特異性、細(xì)胞凝集特異性和糖特異性等。