“鳳丹”油用牡丹籽多酚提取工藝優化及抗氧化活性研究

蔡如玉 常世敏 宋春麗

(1. 河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北 邯鄲 056038；2. 河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071001)

“鳳丹”牡丹既是常見的藥用品種，也是重要的油用品種[1]，在中國各地廣泛種植。目前有關牡丹籽油提取工藝[2]、成分分析[3]、抗氧化活性分析[4]，牡丹籽黃酮提取工藝[5]等方面的研究較多，而關于牡丹籽多酚的提取工藝及其抗氧化活性尚未見報道。

多酚是高等植物中含有多元酚結構的次生代謝產物，廣泛存在于植物根、皮、葉以及果實中[6]。研究[7-8]表明，多酚具有抗菌、抗病毒、抗氧化、降血糖、降血脂、抗動脈硬化、抗衰老及預防心血管疾病等作用。王彥陽等[9]采用超聲波輔助對腰果葉多酚進行了提取，其得率為10.29%；魏春紅等[10]研究了酶法輔助提取小米多酚，最佳提取條件下總酚含量為4.83 mg/g；呂蒙蒙等[11]采用響應面法優化了超聲波—微波協同萃取杉木球果鱗片多酚，其提取率相較于索氏提取法提高了76.58%，且縮短了提取時間；朱素英[12]、陳程等[13]分別采用超聲波輔助對牡丹花和牡丹籽粕中多酚提取進行了研究，其提取率分別為130.627 mg/mL和17.42 mg/g。試驗擬對牡丹籽多酚提取工藝進行優化，并采用體外抗氧化試驗評價其抗氧化活性，為牡丹籽的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“鳳丹”油用牡丹籽：河北國福牡丹科技開發有限公司；

沒食子酸標品、Folin-Ciocalteu試劑：分析純，北京索萊寶科技有限公司；

1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基：分析純，梯希(上海)化成工業發展有限公司；

2,2- 聯氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽：分析純，生工生物工程(上海)股份有限公司；

抗壞血酸、無水乙醇：分析純，天津歐博凱化工有限公司；

過硫酸鉀：分析純，山東西亞化學股份有限公司；

無水碳酸鈉：分析純，天津市紅巖化學試劑廠；

搖擺式高速中藥粉碎機：F-1000型，1 000 g，新昌縣德科機械有限公司；

高速臺式離心機：TGL-10B型，上海安亭科學儀器廠；

高功率數控超聲波清洗器：KQ-200KDB型，昆山市超聲儀器有限公司；

恒溫磁力攪拌器：85-2型，上海司樂儀器有限公司；

紫外—可見分光光度計：MAPADA型，上海美譜達儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 牡丹籽多酚提取 牡丹籽粉碎，過50目篩，稱取5 g，按相應的液料比、乙醇濃度、提取溫度、超聲時間、超聲功率進行多酚提取，5 000 r/min離心10 min， 收集上清液，冷藏備用。

1.2.2 標準曲線的繪制 參照文獻[14]，得標準曲線回歸方程為Y=7.298 8X+0.015 7，R2=0.997 7。

1.2.3 多酚含量的測定 采用福林酚試劑法[15]。按式(1) 計算多酚提取率。

(1)

式中：

R——多酚提取率，mg/g；

C——提取液多酚濃度，mg/mL；

V——提取液體積，mL；

m——樣品質量，g。

1.2.4 單因素試驗

(1) 料液比：精準稱量5 g牡丹籽粉于錐形瓶，分別按料液比1∶10，1∶14，1∶18，1∶22，1∶26 (g/mL)加入60%乙醇，用磁力攪拌器攪拌30 min，于提取溫度55 ℃、超聲功率160 W下提取100 min，考察料液比對多酚提取率的影響。

(2) 超聲時間：精準稱量5 g牡丹籽粉于錐形瓶，按料液比1∶18 (g/mL)加入60%乙醇，用磁力攪拌器攪拌30 min，于提取溫度55 ℃、超聲功率160 W下分別提取60，80，100，120，140 min，考察超聲時間對多酚提取率的影響。

(3) 提取溫度：精準稱量5 g牡丹籽粉于錐形瓶，按料液比1∶18 (g/mL)加入60%乙醇，用磁力攪拌器攪拌30 min，于提取溫度分別為45，50，55，60，65 ℃，超聲功率160 W下提取100 min，考察提取溫度對多酚提取率的影響。

(4) 超聲功率：精準稱量5 g牡丹籽粉于錐形瓶，按料液比1∶18 (g/mL)加入60%乙醇，用磁力攪拌器攪拌30 min，于提取溫度55 ℃、超聲功率分別為120，140，160，180，200 W下提取100 min，考察超聲功率對多酚提取率的影響。

1.2.5 響應面優化試驗 在單因素試驗的基礎上，以料液比、超聲時間、提取溫度、超聲功率為試驗因素，以多酚提取得率為評價指標，設計四因素三水平響應面試驗優化牡丹籽多酚提取工藝條件[16]。

1.2.6 體外抗氧化活性

(1) DPPH 自由基清除能力測定：參照文獻[17]并略有改動，精確稱取1.0 mg DPPH，加入20 mL無水乙醇，避光放置，3.5 h內用完。取2 mL DPPH溶液，加入1 mL 無水乙醇，混勻，室溫避光反應30 min，測定517 nm處吸光度。以抗壞血酸為對照，每組重復3次，取平均值。按式(2)計算DPPH自由基清除率。

(2)

式中：

D——自由基清除率，%；

A0——反應體系吸光度；

A——樣品吸光度；

(2) ABTS自由基清除能力測定：參照文獻[18]并略有改動。精確稱取3.0 mg ABTS，加入0.735 mL蒸餾水超聲輔助溶解，配置7.4 mmol/L的ABTS 儲備液。取1 mg 過硫酸鉀，加入1.43 mL蒸餾水溶解，配置2.6 mmol/mL 的過硫酸鉀儲備液。ABTS儲備液與過硫酸鉀儲備液按體積比1∶1混勻，室溫避光反應12～16 h。用無水乙醇將ABTS母液稀釋40～50倍，測定734 nm處測吸光度。取50 μL不同濃度樣品液，加入ABTS母液950 μL，振動10 s，放置6 min， 測定734 nm處吸光值。以抗壞血酸為對照，每組重復3次，取平均值。按式(2)計算ABTS自由基清除率。

1.2.7 數據處理 單因素試驗結果及體外抗氧化活性采用SPSS軟件進行分析，響應面試驗結果采用Design-Expert 8.0.6軟件進行分析。每個試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對牡丹籽多酚提取率的影響 由圖1可知，多酚提取率隨料液比的不斷增加而下降[19]。綜合考慮，選取1∶18 (g/mL)為最佳料液比。

圖1 料液比對多酚提取率的影響

2.1.2 提取溫度對牡丹籽多酚提取率的影響 由圖2可知，牡丹籽多酚提取率隨提取溫度的升高先上升后下降，當提取溫度為55 ℃時，提取率最大，可能是提取溫度過高導致熱敏感的多酚類物質轉化或降解，從而使提取率降低[17]。故選取55 ℃為最佳提取溫度。

圖2 提取溫度對多酚提取率的影響

2.1.3 超聲功率對牡丹籽多酚提取率的影響 由圖3可知，多酚提取率隨超聲功率的升高先增加后下降，可能是功率過大加快了物料的溫度與提取液的流動，在提高多酚浸出的同時也加快了多酚的分解和氧化。故選取160 W 為最佳超聲功率。

圖3 超聲功率對多酚提取率的影響

2.1.4 超聲時間對牡丹籽多酚提取率的影響 由圖4可知，多酚提取率隨提取時間的延長先增加后下降，可能是多酚隨超聲時間的延長發生氧化、縮合及分解等反應[20-21]。故選取100 min為最佳超聲時間。

圖4 超聲時間對多酚提取率的影響

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 試驗設計與分析 根據單因素試驗結果，以料液比、提取溫度、超聲功率、超聲時間為試驗因素，以多酚提取率為響應值，根據Box-Behnken中心組合原理進行響應面設計，試驗因素與水平表見表1，試驗設計與結果見表2。

表1 響應面因素和水平設計表

表2 響應面試驗設計與結果

2.2.2 模型的建立及方差分析 對表2結果進行統計分析[22]，建立牡丹籽多酚提取率的二次多項回歸方程：

Y=33.28-0.066A+0.16B+0.038C-5.833D+0.038AB+0.083AC+0.013AD-0.047BC-0.023BD+0.033CD-0.090A2-0.19B2-0.082C2-0.13D2。

(3)

2.2.3 響應面分析 進一步對表3進行分析可知，料液比與超聲功率的交互項對牡丹籽多酚提取的含量影響顯著(P<0.05)[24]。由圖5可知，在試驗所選范圍內，AC響應面較為陡峭，響應值存在極值，再次說明料液比與超聲功率交互作用影響顯著[25]。

圖5 兩因素交互作用對提取率的響應面圖

表3 方差分析?

由響應面建立的模型及二次回歸方程預測的最優提取工藝條件為料液比1∶13.74 (g/mL)、提取溫度57 ℃、

超聲功率159.16 W、超聲時間98.44 min，此條件下多酚提取率為33.32 mg/g。為便于操作，將提取工藝條件修正為料液比1∶14 (g/mL)、提取溫度57 ℃、超聲功率160 W、超聲時間98 min，進行3次實驗驗證，得到牡丹籽多酚提取率為33.38 mg/g，與預測值相近，說明該提取模型預測優化牡丹籽多酚提取工藝是準確可行的。

2.3 體外抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力 由圖6可知，DPPH自由基清除能力隨多酚粗提取液濃度的增加逐漸增強，當多酚粗提液濃度為100 μg/mL時，其清除能力達14.17%，低于維生素C的，表明多酚粗提液對DPPH自由基具有一定的清除能力。

圖6 牡丹籽多酚對DPPH自由基的清除能力

2.3.2 ABTS自由基清除能力 由圖7可知，ABTS自由基清除能力隨多酚粗提取液濃度的增加而顯著增強，當多酚粗提取液濃度為40 μg/mL時，其清除能力明顯高于抗壞血酸的，表明多酚粗提液對ABTS自由基有較強的清除能力。

圖7 牡丹籽多酚對ABTS自由基的清除能力

3 結論

試驗表明，牡丹籽多酚的最佳提取工藝條件為料液比1∶13 (g/mL)、提取溫度57 ℃、超聲功率160 W、超聲時間98 min，此條件下的提取率為33.38 mg/g。體外抗氧化試驗發現，牡丹籽多酚粗提液對DPPH自由基和ABTS自由基均具有一定的清除能力，且呈良好的量效關系，表明牡丹籽多酚有可能成為一種新的天然抗氧化劑。后續可對“鳳丹”牡丹籽多酚的代謝途徑、單體種類及功能特性進行研究。