大黃魚肝油提取工藝優化及品質分析

竇 鑫 吳燕燕 楊賢慶 胡 曉 王悅齊

(1. 中國水產科學研究院南海水產研究所農業農村部水產品加工重點實驗室，廣東 廣州 510300；2. 上海海洋大學食品學院，上海 201306)

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)是中國特有的海洋魚類，主要分布于東南沿海，尤其是閩浙沿海地區。2019年，中國魚類產量4 991.06萬t，而海水養殖魚類中，大黃魚產量最高，為19.80萬t[1]。隨著大黃魚產量的逐漸增加，其速凍加工過程產生大量的內臟下腳料，而內臟中大黃魚肝占比達36.65%[2]。

目前，有關大黃魚肝脂質的研究較少[3]，而魚肝中含有豐富的脂質。海水魚油比陸生動物油脂更健康，含有更豐富的多不飽和脂肪酸[4]，特別是長鏈式二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)具有有益健康的作用[5-8]，此類多不飽和脂肪酸通常存在于從魚類(如大黃魚)提取的油脂中[9-10]。目前，從魚肝臟中提取油脂的方法較多，主要有蒸煮法[7]、壓榨法[11]、溶劑抽提法[12-13]、淡堿水解法[14]以及酶解法[15-18]等。酶解法具有生產條件溫和、得率高、產品質量好的特點，蛋白酶水解原料產生的水解液富含氨基酸等物質可進一步加工利用[11]。試驗擬以酶法提取大黃魚肝中油脂，優化其提取工藝，并分析大黃魚肝油的品質特性，旨在為其利用開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

大黃魚肝臟：寧德市金盛水產有限公司；

木瓜蛋白酶(20萬U/g)、堿性蛋白酶(200 U/mg)：上海麥克林生化科技有限公司；

中性蛋白酶(200 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)：合肥博美生物科技有限責任公司；

胃蛋白酶：3 000～3 500 NFU/mg，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器設備

鹽酸：分析純，廣州化學試劑廠；

14%三氟化硼—甲醇溶液：分析純，上海安譜科學儀器有限公司；

氯仿、甲醇、氫氧化鈉、正己烷和氯化鈉：分析純，廣州輝俊生物科技有限公司；

韋氏試劑：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

石油醚：分析純，天津市富宇精細化工有限公司；

氣相色譜—質譜聯用儀：QP2010型，日本島津公司；

均質機：IKA-T50型，德國IKA公司；

臺式低速離心機：TDZ5-WS型，湖南湘儀離心機有限公司；

脂肪分析儀：Soxtec TM 2050型，丹麥Foss公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理 將大黃魚肝臟經自然解凍后，使用組織搗碎機破碎，制備肝臟勻漿。

1.3.2 大黃魚肝脂肪的測定 按GB 5009.6—2016執行。

1.3.3 酶解法提取大黃魚肝油 稱取適量經預處理后的大黃魚肝勻漿于錐形瓶中，依次按不同的料液比及pH，并向其中加入一定量的酶，混勻。將錐形瓶置于恒溫振蕩器中，一定溫度下進行酶解，105 ℃烘箱滅酶15 min，趁熱離心，分離上層油相，備用。

1.3.4 單因素試驗設計

(1) 酶種類：固定料液比1∶2 (g/mL)，酶用量1.5%，酶解時間3.5 h，分別用胰蛋白酶(50 ℃，pH 7.5)、木瓜蛋白酶(50 ℃，pH 6.5)、中性蛋白酶(50 ℃，pH 7.0)、堿性蛋白酶(50 ℃，pH 8.0)、胃蛋白酶(45 ℃，pH 2.5)進行酶解，考察酶種類對大黃魚肝油提取率的影響。

(2) 料液比：固定中性蛋白酶添加量1.5%，酶解時間3.5 h，酶解溫度50 ℃，pH 7.0，考察料液比[1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5 (g/mL)]對大黃魚肝油提取率的影響。

(3) 中性蛋白酶添加量：固定料液比1∶2 (g/mL)，酶解時間3.5 h，酶解溫度50 ℃，pH 7.0，考察中性蛋白酶添加量(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%)對大黃魚肝油提取率的影響。

(4) 酶解溫度：固定料液比1∶2 (g/mL)，中性蛋白酶添加量1.5%，酶解時間3.5 h，pH 7.0，考察酶解溫度(40，45，50，55，60 ℃)對大黃魚肝油提取率的影響。

(5) 酶解時間：固定料液比1∶2 (g/mL)，中性蛋白酶添加量1.5%，酶解溫度50 ℃，pH 7.0，考察酶解時間(1.5，2.5，3.5，4.5，5.5 h)對大黃魚肝油提取率的影響。

(6) pH：固定料液比1∶2 (g/mL)，中性蛋白酶添加量1.5%，酶解時間4.5 h，酶解溫度50 ℃，考察pH值(6.0，6.5，7.0，7.5，8.0)對大黃魚肝油提取率的影響。

1.3.5 響應面試驗設計 在單因素試驗基礎上根據SPSS顯著性差異分析(P<0.05)，以酶添加量、pH、酶解時間、酶解溫度為試驗因素，以提取率為響應值，設計四因素三水平響應面試驗優化大黃魚肝油提取工藝條件。

1.3.6 理化性質分析

(1) 感官評價：按SC/T 3502—2016執行。

(2) 酸價：按GB 5009.229—2016執行。

(3) 碘值：按GB/T 5532—2008執行。

(4) 水分及揮發物：按GB 5009.236—2016執行。

1.3.7 大黃魚肝油提取率的測定 按式(1)計算大黃魚肝油提取率[14]。

(1)

式中：

c——大黃魚肝油提取率，%；

c1——大黃魚肝脂肪含量，g/100 g；

m1——大黃魚肝臟質量，g；

m2——大黃魚肝油質量，g。

1.3.8 脂肪酸成分分析 向大黃魚肝油中加入14%三氟化硼—甲醇溶液2 mL，60 ℃水浴30 min，冷卻，加入1 mL 正己烷和蒸餾水振蕩搖勻。靜置分層后，用注射器通過0.22 μm有機濾膜過濾獲得上清液，上清液經GC-MS分析[19-20]。

(1) 色譜條件：色譜柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；進樣溫度250 ℃；分流比1∶30，進樣體積1 μL，流速1.52 mL/min，載氣為高純氦；加熱程序為110 ℃ 加熱4 min，10 ℃/min加熱1 min，然后4 ℃/min加熱1 min；升溫至210 ℃持續3 min，最后以4 ℃/min升溫至240 ℃，并持續8 min。

(2) 質譜條件：離子源溫度200 ℃；電源電壓70 eV；溶劑延遲時間3 min。

1.4 數據處理

分別使用計算機NIST 0.5譜庫數據庫以及MS圖庫中的標準譜圖進行檢索與比較，確認大黃魚肝油中脂肪酸甲酯成分，采用面積歸一化法(以峰值面積的百分比表示)測定脂肪酸的百分含量[21-22]。各試驗平行3次，結果表示為平均值±標準差。采用 Excel 軟件繪圖，采用SPSS統計分析軟件的ANOVA和Duncan 法(α=0.05)分析魚油脂肪酸含量，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶種類 由圖1可知，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶對大黃魚肝油的提取效果較好，其中中性蛋白酶魚油的提取率最大，為69.02%。綜上，選用中性蛋白酶作為大黃魚肝油的提取用酶。

圖1 酶種類對大黃魚肝油提取率的影響

2.1.2 料液比 由圖2可知，大黃魚肝油提取率隨料液比的增加先增大后減少，當料液比為1∶2 (g/mL)時，提取率最大為72.13%。料液比過低，其酶濃度分布不均，故與底物間的反應不充分，導致提取率降低；而料液比濃度過高，底物的濃度就會減少，這樣酶與底物的接觸機會減少，提取率也會降低[23-24]。綜上，選擇最佳料液比為1∶2 (g/mL)。

圖2 料液比對大黃魚肝油提取率的影響

2.1.3 酶添加量 由圖3可知，大黃魚肝油提取率隨酶添加量的增加先升高后趨于平穩，當酶添加量為1.5%時，提取率最高為72.13%。劉超等[23-24]研究發現鱈魚肝油提取率隨酶用量的增加而降低，可能與酶種類有關，酶用量過大，其水解能力加強，原料中的油脂被降解，提取率下降。故最適酶添加量為1.5%。

圖3 酶添加量對大黃魚肝油提取率的影響

2.1.4 酶解溫度 由圖4可知，大黃魚肝油提取率隨酶解溫度的增加先升高后降低，當酶解溫度為50 ℃時，提取率最大為72.13%，這是由于50 ℃是中性蛋白酶的最佳酶解溫度，故此溫度下大黃魚肝油的提取效果最好。酶解溫度過高或過低會使酶變性或失活，酶反應速率下降，魚油提取率較低。故選擇最適酶解溫度為50 ℃。

圖4 酶解溫度對大黃魚肝油提取率的影響

2.1.5 酶解時間 由圖5可知，大黃魚肝油提取率隨酶解時間的增長先不斷提高后趨于穩定。當酶解時間為4.5 h 時，提取率達最大，為71.49%。由于大黃魚肝油經過長時間的酶解會導致魚油被空氣氧化，使大黃魚肝油品質下降，故選擇最適酶解時間為4.5 h。

圖5 酶解時間對大黃魚肝油提取率的影響

2.1.6 pH 由圖6可知，大黃魚肝油提取率隨pH的升高先緩慢上升后迅速下降，當pH為7.0時，提取率最高，為71.36%。故選擇最適酶解pH為7.0。

圖6 pH對大黃魚肝油提取率的影響

2.2 響應面優化設計

2.2.1 試驗設計與結果分析 根據單因素試驗結果，以大黃魚肝油提取率為響應值，根據Box-Behnken中心組合原理進行響應面設計，試驗因素水平表見表1，試驗設計與結果見表2。

表1 試驗因素水平表

表2 響應面試驗設計與結果

利用Design-Expert 11.1.0.1軟件對響應面試驗結果進行多元回歸擬合，得到以大黃魚肝油提取率(Y)為響應值的二次多項式回歸方程：

Y=69.79+1.84A+1.94B-1.54C+0.674 2D+3.93AB-0.207 5AC-1.35AD+3.29BC-2.02BD-3.19CD+1.94A2+0.925 0B2+1.81C2-7.81D2。

(2)

表3 方差分析?

2.2.2 試驗因素間的交互作用 由圖7可知，交互項AB、BC以及CD對大黃魚肝油提取率存在顯著影響(P<0.05)，交互項AC與AD對大黃魚肝油提取率的影響不顯著，與方差分析結果一致。

圖7 各因素間的交互作用

2.2.3 驗證實驗 經響應面分析得最佳酶解工藝條件為中性蛋白酶添加量2.49%、pH 7.32、酶解時間4.01 h、酶解溫度50.25 ℃，此條件下大黃魚肝油提取率為79.05%。為檢驗響應面結果的可靠性，實際選取最優工藝參數為中性蛋白酶添加量2.5%、pH 7.3、酶解時間4.0 h、酶解溫度50.3 ℃，進行驗證實驗(n=3)，得實測提取率為78.39%，與預測值相差0.66%，證明用所建模型預測大黃魚肝油提取率是準確可行的。

2.3 大黃魚肝油的品質分析

由表4可知，酶法提取的大黃魚肝油提取率為(78.39±1.91)%，比淡堿法提高了1.8倍。酶法提取的大黃魚肝油呈黃色、較澄清，氣味具有魚肝油的腥味，而淡堿法提取的大黃魚肝油呈深黃色、且有少量渾濁，氣味具有魚肝油的腥味，稍有魚肝油的酸敗味，這是因為淡堿法在水解過程中溫度過高，部分不飽和脂肪酸氧化[24]，最終導致大黃魚肝油品質下降。酶法提取的大黃魚肝油酸價低于淡堿法的，碘價雖略高于淡堿法的但仍符合SC/T 3502—2016。

表4 酶法與淡堿法提取的大黃魚肝油品質比較?

2.4 大黃魚肝油的脂肪酸組成

由表5可知，酶解法與淡堿法提取的大黃魚肝油中脂肪酸組成差異極顯著(P<0.01)，酶解法魚油中共檢出13種脂肪酸，其中飽和脂肪酸5種，單不飽和脂肪酸3種，多不飽和脂肪酸5種。淡堿法魚油中共檢出8種脂肪酸，其中飽和脂肪酸3種，單不飽和脂肪酸2種，多不飽和脂肪酸3種。淡堿法中總飽和脂肪酸含量為30.35 g/100 g，高于酶解法的(19.71 g/100 g)；酶解法魚油中單不飽和脂肪酸含量為62.63 g/100 g，淡堿法的為51.97 g/100 g，二者具有極顯著性差異(P<0.01)；兩種制備方法的多不飽和脂肪酸總量相差相對較小。

表5 大黃魚肝油的脂肪酸組成?

2.4.1 飽和脂肪酸 兩種方法制備的大黃魚肝油中，C18:0(硬脂酸)與C16:0(棕櫚酸)含量有較大差異，淡堿法魚油的硬脂酸和棕櫚酸分別為酶法的1.6倍。研究[25-26]表明，硬脂酸可以降低膽固醇吸收，從而降低血清和肝臟中的膽固醇水平，對人體起一定保護作用。棕櫚酸可以降低血清中膽固醇含量，是心臟運動期間合成的首選脂肪酸[27]。淡堿法魚油的飽和脂肪酸含量雖略高于酶解法的，但其飽和脂肪酸種類少于酶法的，其中C14:0(肉蔻酸)與C17:0(珍珠酸)在淡堿法中未檢出。

2.4.2 單不飽和脂肪酸 酶法魚油的單不飽和脂肪酸含量更為豐富，高于鰻魚肝油的[28]。其中C17:1在淡堿法與鰻魚肝油中未檢出。酶法魚油的C16:1(棕櫚油酸)含量較多，為淡堿法的1.7倍，其C18:1(油酸)含量也相對較多，說明酶法提取對魚肝中單不飽和脂肪酸的破壞較小，而油酸和棕櫚油酸的結合對緩解血栓形成、降低心律失常和中風風險、降低低密度脂蛋白(LDL)膽固醇水平和提高高密度脂蛋白(HDL)濃度具有積極作用，這些作用有助于降低血壓和增加動脈血管舒張[29-30]。

2.4.3 多不飽和脂肪酸 酶法魚油中多不飽和脂肪酸種類高于淡堿法的，其含量高于鰻魚肝油中的[28]。酶法魚油中含有少量C20:3(花生三烯酸)和C20:4(n-6)(花生四烯酸)，而淡堿法中未檢出。C18:2(n-6)(亞油酸)為含量最高的多不飽和脂肪酸，酶法、淡堿法魚油中亞油酸含量分別為(12.64±0.26)，(14.71±0.61) g/100 g。亞油酸是一種必需脂肪酸，為磷脂的重要組成部分；又是合成前列腺素的前體，有利于皮膚修復，對促進生長發育、視力和肝腎功能發揮重要作用。臨床和流行病學研究[31]表明，EPA和DHA僅存在于魚類和海產品中，并且在預防人類冠狀動脈疾病中起著極其重要的作用。

3 結論

試驗表明，大黃魚肝油的最佳酶解工藝為中性蛋白酶添加量2.5%、料液比1∶2 (g/mL)、pH 7.3、酶解時間4.0 h、酶解溫度50.3 ℃，此工藝條件下提取率達78.39%，比一般的淡堿法提高了1.8倍，且魚肝油澄清，酸價僅為(5.83±0.15) mg/g，碘價為(142.65±0.22) mg/100 g，其脂肪酸組成更為豐富，共檢出13種脂肪酸，其中飽和脂肪酸5種，單不飽和脂肪酸3種，多不飽和脂肪酸5種。而淡堿法魚肝油中僅檢測到8種脂肪酸，且以飽和脂肪酸為主，因此，酶解法的大黃魚肝油提取率及脂肪酸組成均優于傳統淡堿法。后續可進一步制備大黃魚肝活性肽。