Visfatin基因啟動子區域的遺傳變異與中國北方漢族人群缺血性卒中發病風險研究

朱瑞霞，王倩雯，劉 旭，何志義

缺血性卒中(IS)是所有卒中中最常見的類型，占卒中的70%以上[1]，其發病率、致殘率、死亡率均高，嚴重影響人類的健康。IS是一種復雜的疾病，受到遺傳和環境因素的共同影響[2]。炎癥在動脈粥樣硬化發生中發揮了重要作用，而動脈粥樣硬化則是缺血性卒中的主要病因。Visfatin(又稱前B細胞集落增強因子)是一種在內臟脂肪中明顯表達的新型促炎性脂肪因子[3]。Visfatin是一種分子量為52-55kDa的蛋白質，最初發現它可以作為生長因子，增強干細胞和白介素7對于前B細胞分化的作用[4，5]。最近的研究表明，visfatin在炎癥相關的動脈粥樣硬化過程中發揮了重要作用。據報道，血清visfatin水平與血清中IL-6和IL-1β及TNF-α的水平呈正相關，表明循環的visfatin可能影響了炎癥狀態[6，7]。Visfatin還被證明其可能對斑塊不穩定化有所影響[8]。

有研究表明visfatin啟動子多態性與急性炎癥損傷及慢性輕度炎癥反應都有所關聯[9，10]。rs61330082單核苷酸多態性位于visfatin遠端的啟動子區域，包含了多個CAAT盒和TATA樣序列以及CCAAT/NF-1，NF-B，NF-IL-6，GR和AP-1的結合位點，并與visfatin基因表達和血清脂質水平的調節相關[11～13]。在Ooi等的研究中，發現visfatin及其遺傳變異體的表達水平在兒童中與肥胖相關及不良心臟代謝的參數有關，如甘油三酯及嚴重的高血壓等，證明了visfatin在心血管代謝性疾病領域的重要作用[14]。接著他們的團隊進一步在分子水平體外實驗中對上述結論進行了補充研究，證明了在肥胖兒童中，在visfatin上游啟動子區域的 rs11977021及 rs61330082的調節下，可提高體外轉錄的活性，進而影響下游蛋白的水平及個體表型[15]。上述研究闡述了內脂素visfatin及其遺傳變異體在血脂水平及炎癥通路中的調節作用，并暗示其表達水平及基因多態性可能與動脈粥樣硬化性血管疾病的易感性相關。據我們所知，目前尚未發表有關rs61330082多態性與IS發病風險之間關系的研究，本篇文章旨在探索rs61330082多態性與缺血性卒中的發病風險的關系。

1 材料和方法

1.1 研究對象 本研究納入了年齡、性別相匹配的368例患者和381例健康對照。我們收集了從2011年9月至2012年9月在中國醫科大學附屬第一醫院神經內科住院的患者，根據神經系統檢查和影像學資料，將首次診斷為急性缺血性卒中的患者定義為符合納入條件的病例組。而短暫性缺血性發作，腦栓塞，腦外傷，腦血管畸形，凝血功能異常，自身免疫性疾病，腫瘤和慢性感染疾病的患者均被排除在外。另外，我們選擇了來自紅十字會醫院未見卒中及其他神經系統疾病的體檢者作為對照組。所有受試者均來自生活在中國北方的漢族人群。兩家醫院的倫理委員會均批準了本項研究，且所有參與者均簽署了書面知情同意書。病例組和對照組的臨床記錄，包括一般狀況(如性別，年齡，種族，吸煙和飲酒史)，既往史，家族史，血壓，空腹血糖，血清甘油三酸酯(TG)和總膽固醇(TC)。此外，患者還需要行頭部CT或MRI，超聲心動圖，頸動脈超聲，經顱多普勒檢查和心電圖檢查。高脂血癥定義為血漿總膽固醇水平>5.72 mmol/L和(或)血漿甘油三酸酯水平> 1.7 mmol/L，或有降血脂藥物治療史。

1.2 DNA提取和基因分型 采用DNA純化試劑盒(Promega，Madison，USA)提取200 μL EDTA抗凝外周血的基因組DNA，并用分光光度法測量DNA純度，并將DNA樣品置于-80℃冰箱中保存。使用聚合酶鏈反應-連接檢測反應(PCR-LDR)方法對基因組DNA進行基因分型。表1列出了用于PCR的引物序列。PCR擴增體系的總體積為10 μl，包括1×GC-I緩沖液(Takara)，3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTP，1 U熱啟動Taq聚合酶(Qiagen Inc)，1 μl基因組DNA和每個對應的1 μl引物。循環參數如下：95 ℃預變性2 min；94 ℃變性20 s，65 ℃退火40 s，72℃延伸90 s，共11個循環；在94 ℃下持續20 s，59 ℃下持續30 s，72 ℃下持續90 s，共24個循環；最后在72 ℃下延伸2 min。LDR的探針在表1中列出。每個PCR產物的連接檢測反應的體積為10 μl，其中包含1 μl 10×連接緩沖液，2 μl PCR產物，6 μl雙蒸餾水，0.4 μl每個區分探針和0.25 μl Taq DNA連接酶(New England Biolabs，USA)。LDR參數如下：94 ℃ 60 s，56 ℃ min，共38個循環。反應后，將5 μl LDR反應產物與9 μl Hi-Di ROX(Applied Biosystems，USA)及0.5 μl的上樣緩沖液混合，然后在95 ℃下變性5 min。最后用ABI Prism 3730XL DNA測序儀(Applied Biosystems，USA)分析混合物。

表1 Primer sequences and the probes for LDR

2 結 果

實驗組和對照組的基本臨床特征見表2。年齡和性別在病例組和對照組分布無明顯差異，然而，病例組中患有高血壓、糖尿病及高脂血癥，以及吸煙者、飲酒者的個體比例顯著高于對照組。

表2 病例組與對照組臨床資料比較

表3和表4分別列出了病例組和對照組rs61330082的基因型和等位基因頻率。SNP rs61330082在病例組及對照組人群中的基因型的頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳定律，說明本研究納入的人群具有群體代表性。(病例組，P=0.630；對照組，P=0.139)。實驗組中，AA，AG和GG基因型頻率分別為27.99%，48.64%和23.37%，其在對照組中依次為25.99%，46.19%和27.82%。與(AA+AG)相比，GG基因型的個體罹患卒中的風險并沒有增加，缺血性卒中的患者同對照組相比，其等位基因分布也沒有顯著差異(P=0.163)。而分別在男性及女性的卒中患者同對照組進行性別特異性分析中，仍未見明顯的統計學差異(P=0.159；P= 0.684)。

表4 男性及女性病例組與對照組rs61330082位點基因型及等位基因頻率比較

我們使用Logistic回歸模型去計算visfatin基因型與缺血性卒中發病風險之間的相關性(見表5)。即使校正了其他可能的混雜因素，包括年齡，性別，吸煙，飲酒，高血壓，糖尿病，高脂血癥，仍未在病例組及對照組人群中觀察到顯著的統計學差異(OR=1.378；95%CI=0.971～1.955；P=0.073)。

表5 rs61330082位點Logistic回歸結果

3 討 論

據我們所知，這是第一篇評估visfatin基因變異體與缺血性卒中發病之間相關性的研究。本研究中，我們未能在中國北方漢族人群中觀察到visfatin單核苷酸多態性rs61330082與缺血性卒中間發病存在顯著的相關性。此外，當我們根據性別進行亞組分析后，仍未觀察到visfatin SNP rs61330082與IS疾病之間存在顯著的統計學差異。

Visfatin可能在斑塊不穩定過程中發揮作用，而不穩定斑塊是缺血性卒中的主要病因之一。Dahl發現visfatin是一種定位于不穩定動脈粥樣硬化斑塊中泡沫細胞及巨噬細胞內的炎性介質[8]。Visfatin能夠誘導內皮細胞中的血管內皮生長因子(VEGF)和基質金屬蛋白酶(MMP)的產生[16]，提示其在血管炎癥的病理過程中發揮了至關重要的作用。此外，Kim等[17]證明visfatin是一種血管炎性分子，可通過內皮細胞中ROS依賴性NF-κB激活途徑來增加炎性因子CAM，ICAM-1和VCAM-1的表達。

Vander等指出[18]，visfatin可以有助于血管平滑肌細胞(SMC)穩定、成熟表型的形成，并可以通過調節煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)生物合成來增加平滑肌細胞生成血管的能力。Leander及其同事證明了在visfatin基因啟動子區域中罕見的SNP rs1319501可能與45～60歲女性的首次罹患心肌梗死有關[19]。Wang等提出rs61330082多態性與冠狀動脈疾病患者血漿中炎癥標志物水平降低有關[20]。在Yan等[21]研究中指出，rs61330082基因多態性與降低發生冠狀動脈疾病(CAD)的風險密切相關，尤其是在年輕，男性受試者和非吸煙者中。劉等[22]也有報道指出血漿visfatin水平與CAD顯著相關，并獨立于其他傳統的CAD危險因素。Jin及其團隊研究發現，血清visfatin的水平在實驗組即冠狀動脈鈣化患者中，明顯高于對照組，證明其與疾病的發展相關，對于其基因多態性rs61330082，其等位基因C(C>T)的頻率在中重度患者組中明顯高于對照組及輕度患者組，且差異有統計學意義，表明T基因可能對冠脈鈣化的患者具有保護作用[23]。因此，我們假設rs61330082多態性可能與缺血性卒中的易感性相關。

在我們的研究中，病例組患糖尿病和高血壓以及吸煙者，飲酒者，高血脂個體明顯多于對照組，提示吸煙、糖尿病、高血壓、飲酒和高血脂為缺血性腦卒中發病的風險因素。rs61330082位點在共顯性、顯性、隱性和等位基因模型病例組與對照組之間無明顯差異，提示visfatin rs61330082多態性與缺血性卒中發病無關。此外，當我們根據性別對患者進行分層分析時，在男性及女性患者組我們仍沒有觀察到visfatin rs61330082多態性與IS疾病之間的關聯。

盡管我們先前的功能性研究證明了visfatin在動脈粥樣硬化的發病機制中的重要作用，并且早前的遺傳學研究支持visfatin多態性在動脈粥樣硬化相關疾病中發揮作用，但我們目前的結果表明visfatin在缺血性卒中中并未起到顯著的作用。本研究在中國北方漢族人群中缺乏關聯的原因可能有以下幾種：(1)缺血性卒中是由不同實體組成的異質性表型，因此CAD和缺血性卒中之間存在遺傳效應的差異并不罕見。(2)我們的研究僅在中國北方漢族人群中進行，他們在世界范圍內擁有自己獨特的基因背景。(3)我們選擇的人群的樣本量太小，未來更大規模、多種族的研究可能會豐富我們的結果。(4)其他可能的原因可能由于種族、地域的差異，研究設計，檢測方法及選擇偏倚等。盡管當前研究中提供的數據并不能夠表明visfatin rs61330082與IS相關，但在先前的研究中，大量呈現了其與動脈粥樣硬化樣血管疾病及肥胖、血脂等指標的相關性，因此我們不能完全排除visfatin及其他基因多態性對缺血性腦卒中疾病易感性的潛在影響，而應該多方面考慮并謹慎解釋這一結果。

綜上，我們的實驗證明了rs61330082單核苷酸多態性可能與中國北方漢族人群中缺血性卒中的易感性無關。但是，未來仍需要進行更大范圍和種族人群多樣化的進一步研究，以更好地了解rs61330082多態性與IS的關聯。