強筋健骨方對PMOP大鼠骨密度及生物力學影響的實驗研究

樓家暉 楊鶇祥 鄭明軒 楊永菊 王洪旭

1.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110032 2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以成熟骨量減少，骨組織結構破壞，骨強度受損，極易發生骨痛等疾病的全身性骨病。研究表明[1]，現有的西藥、雌激素等防治手段具有誘導惡性腫瘤、骨壞死等不良反應，而中藥復方具有整體治療及副作用小的優點，是防治骨質疏松癥的新方向。臨床實踐證實，中醫“腎主骨生髓”“肝主筋”理論指導下的中藥復方對骨密度(bone mineral density，BMD)增加、成骨細胞的形成及骨生物力學特性具有促進作用[2-5]。本實驗通過研究“強筋健骨方”對絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)大鼠骨密度及生物力學的影響，為下一步臨床試驗提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選用60只3月齡未經產雌性SD大鼠，體質量(204±16) g，購自遼寧長生生物技術有限公司，生產批號：SCXK(遼).2015-0001。

1.2 藥物與試劑

強筋健骨方配制：組成：淫羊藿、懷牛膝等。用去離子水將顆粒配置成藥液，于4℃冰箱密封保存，灌胃前水浴法加熱至37℃，超聲混勻，冷卻至室溫(25℃)；尼爾雌醇片(大連美侖生物技術有限公司，批號：15020302)。

1.3 主要儀器

三點力學生物儀，上海能共實業有限公司，DMS 雙能 X 線骨密度儀(型號：starosDR)。

1.4 動物造模

除Sham組外，其余組均采用如下所述造模方法：全程嚴格按照無菌操作進行，術前禁食8 h，不禁水。配制2%戊巴比妥鈉溶液(40 m/kg)，提捏大鼠后頸部肌肉，伸直右側大腿，肌注麻醉后，術區被皮、碘伏消毒，切口部位選取大腿根部向上1.5 cm 處，用手術刀片切開表皮、肌肉等組織，找到淡粉色卵巢，牽出淡粉色卵巢，結扎卵巢與子宮結合部，剪去卵巢。術區用碘伏消毒后，分籠飼養，暖光燈照射，維持大鼠體溫，自由攝取食物與水，密切觀察大鼠情況。術后切口邊緣注射青霉素20萬單位抗菌消炎。Sham組僅取卵巢旁1 cm3大小脂肪組織進行切除，不進行結扎輸卵管與切除卵巢等操作，其余處置同上。

1.5 動物分組與給藥

60只大鼠隨機分為6組，每組10只，分別為Sham組、OVX組、E2組、“強筋健骨方”低、中、高劑量組(JGG、JGZ、JGD)。造模后，Sham、OVX組給予等量生理鹽水，E2組給藥濃度12 μg/(kg·d)，“強筋健骨方”三劑量組(分別相當于成人劑量1、2、3倍)分別給予制備好的“強筋健骨方”水煎液，低中高組給藥濃度分別為5.56 g/(kg·d)、11 g/(kg·d)、22 g/(kg·d)。

1.6 檢測指標

1.6.1BMD測定：定將麻醉后大鼠仰臥位平放于骨密度儀測試臺上，最大程度伸展大鼠股骨，使股骨充分暴露于X線下，打開骨密度儀掃描雙側股骨，測量骨密度數值。

1.6.2骨礦含量(bone mineral content，BMC)測定：含量剔出大鼠雙側側股骨，清理周圍肌肉組織，干燥箱中(溫度90 ℃)烘干1 h，天平稱重(精確度：0.1 mg)。電爐炭化后置入馬福爐(800 ℃)2 h，待骨灰冷卻后，電子天平稱重。3%硝酸溶液10 L分別加入0.05 g和0.1 g灰質，移至25 L的比色管中，室溫下放置48 h，溶液呈無色透明，測試骨礦含量。

1.6.3骨組織形態學觀察：取股骨用4%多聚甲醛溶液固定，EDTA脫鈣液脫鈣，以長針可刺入為準。流水過夜沖洗股骨，定量濃度乙醇浸泡，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察骨組織形態。

1.6.4骨生物力學測定：應用骨生物力學方法來進行骨質疏松的相關研究是其中較好的手段，可反映骨的宏觀力學效應及骨質性能(強度、硬度、韌性等)之間的關系。目前，骨質疏松研究中用來評價長骨生物力學性能的試驗主要是三點彎曲試驗，可以良好地反映骨質疏松動物長骨的生物力學變化，而且具有操作方便的優點[6]。其中，測定的結構力學指標包括反映骨內在性能指標彈性模量(Young modulus)、骨應力(Maximum stress)和骨外在性能指標最大負荷(Maximum load)、結構硬度(Stiffness)及能量吸收 (Energy)等[7]。

實驗步驟：實驗采用CTM2050S萬能拉力試驗機，取右股骨全長，放入室溫下的生理鹽水當中浸泡3 h，取出恢復室溫，兩端用黏膠澆鑄后放在間距為22 mm三點壓縮實驗臺上，標本橫截面短軸的方向與加速度方向一致，最大加載速度2 mm/min，啟動壓力架開關，待股骨斷裂后計算機得出各生物力學數據。

1.7 統計學處理

實驗結果表示為均數±標準差，SPSS 20.0版軟件分析，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊采用t檢驗，不齊采用非參數檢驗。

2 結果

2.1 強筋健骨方對去勢雌性大鼠各組間BMD及BMC的影響

與OVX組相比，其余組大鼠骨密度差異均有統計學意義，且OVX組BMD值明顯小于其余組(P<0.01)；與E2相比，JGG組差異有統計學意義，且BMD值大于E2組(P<0.01)；“強筋健骨方”三組相比，JGD與JGG差異有統計學意義，且數值小于JGG組(P<0.01)；與OVX組相比，除JGD組外其余組差異均有統計學意義，且數值均大于OVX組(P<0.05)；與E2組相比，“強筋健骨方”三組差異均無統計學意義(P>0.05)；“強筋健骨方”三組相比差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠股骨骨密度及骨礦含量的比較

2.2 強筋健骨方對去勢雌性大鼠各組間股骨生物力學比較

骨應力、彈性模量為反映骨生物力學較為特異性指標，OVX組與其余組除JGD組外相比，骨應力與彈性模量差異均有統計學意義，且數值均大于OVX組(P<0.05)；E2組與強筋健骨方三劑量組相比，骨應力與JGD組差異有統計學意義，且數值大于JGD組(P<0.01)，彈性模量與JGZ、JGD組相比差異有統計學意義，且數值大于中低組(P<0.05)；強筋健骨方三組比較，骨應力JGG組與JGD組差異有統計學意義，且JGG組大于JGD組(P<0.01)，彈性模量JGG組與其余組比較差異有統計學意義，且數值大于其余組(P<0.05)。見表2。

2.3 大鼠股骨組織學

將股骨切片光鏡下顯示，Sham組骨小梁排列整齊，骨小梁較為飽滿，形態結構完整，骨髓腔小；OVX組骨小梁形態結構出現破壞，骨小梁之間間隙變大，連接性變差，骨髓腔變大；E2組遭到破壞骨小梁明顯減少，骨小梁相對飽滿，骨小梁排列整齊，尚可連接成網，髓腔較小；“強筋健骨方”三劑量組骨小梁結構改善顯著，骨小梁相比OVX組間距縮短，排列整齊，髓腔減小。見圖1。

表2 各組大鼠股骨生物力學性能比較Table 2 Comparison of biomechanics of the femur among the

圖1 各組大鼠股骨HE 染色結果(10×10)Fig.1 He staining results of the femurs of rats in each group(10×10)

3 討論

據相關調查[8]，中國大陸接近14億的人口中，患有骨質疏松癥的人群接近20%(40歲以上)，因OP帶來的骨折、全身性骨痛等問題嚴重影響人們的健康，骨質疏松癥在中國古代屬于“骨萎”的范疇。在“未病防變”的思想下，基于“肝主筋”“脾主肉”“腎主骨”理論，以“養肝、健脾、補腎”為根本治法，促使機體達到“筋強、肉實、骨豐”的生理狀態，從而防治骨質疏松癥。本文從“補腎、活血”治法為切入點進行復方對OP治療作用的研究，通過查閱文獻發現，這類中藥復方確有促進骨形成，抑制骨吸收，從而起到防治OP的作用[9]。OP的治療除了滋補三臟來化生氣血、強筋健骨之外，還應注重活血利氣，以此達到OP的治療目的，一些以活血利氣的復方在OP大鼠的基因表達方面，確能產生一種或者幾種物質(如血管內皮生長因子)，在骨組織的生長、發育與修復過程中(包括大鼠BMD、VEGF蛋白含量及mRNA表達量)起著重要作用[10]。從而提出了“補臟器以調氣血，調氣血以利筋骨，臟腑調達，筋強骨健”的理論，并將該理論進行深化，研制出治療OP的效方“強筋健骨方”，將其進行實驗研究，并為下一步的臨床研究提供實驗基礎。

本實驗采用PMOP大鼠模型，該種OP動物模型是1969年由Saville建立[11]，是目前研究絕經后OP最常見、最可靠的動物模型之一[12]。總結相關文獻，發現中藥及復方具有改善實驗大、小鼠生物力學、骨形成、骨吸收、BMD等指標的作用[13-24]。如蒙海燕等[25]用鹿茸及鹿角膠對去勢大鼠灌胃后發現大鼠的骨密度、骨礦物含量及骨組織形態學都有一定程度的改善；韋大文等[26]再用補腎方治療去勢大鼠OP后，大鼠骨組織形態學如骨松質、骨小梁結構等都有了明顯的改善；毛春煥等[27]在用骨松健骨方治療去勢OP大鼠后，大鼠骨小梁數目增加，骨小梁間隙降低，骨生物力學性能也得到了明顯的提升。

實驗通過三點彎曲試驗、BMD、BMC及骨組織形態學來探究強筋健骨方對OP模型的骨生物力學的影響。去勢致大鼠OP導致BMD下降，有效骨量降低，骨密質變薄，骨的微觀結構破壞從而導致骨生物力學的改變，容易發生骨折[28-30]。彈性模量及骨應力是骨生物力學性能的綜合體現，與骨骼的長短尺寸關系較小，可以較為可靠地展現材料的內在生物力學特性[31-32]。結果顯示，與Sham組相比，OVX組大鼠生物力學性能明顯下降，通過觀察股骨彈性模量及股骨骨應力，可反映出OVX組大鼠骨外在的宏觀力學性能明顯減退。與OVX組去勢雌鼠相比較，E2組及強筋健骨方高、中劑量組的最大負荷、彈性模量及骨應力均顯著提高，JGD組也有所提高，猜測強筋健骨方在減少骨吸收，促進骨生成的同時，還提高了股骨的生物力學特性，使其不易發生骨折，并且本實驗還發現股骨生物力學特性優劣與給藥劑量有一定的相關性。

研究表明[33]，去勢后大鼠血清ER含量減少會使甲狀旁腺功能亢進，進而引發過多的甲狀旁腺素分泌，致使骨吸收旺盛，骨形成抑制，從而降低BMD，誘發OP。OVX組BMD、BMC值均小于Sham組與、E2組，說明造模成功，正符合造模PMOP大鼠生理特性。與OVX組相比，JGG、JGZ組BMD與BMC數值均明顯大于OVX組；與E2相比較，JGG、JGD組BMD均顯著提高，雖然BMD組骨礦含量增高與模型組相比較不具有統計學意義；強筋健骨方三組間比較，JGG組BMD值大于其余兩組。綜合分析，強筋健骨方三組可以顯著提高股骨密度及骨礦含量的作用，且JGG組表現較為優越。

實驗結果顯示強筋健骨方能夠有效增加PMOP大鼠BMD與BMC的作用，并且可以有效改善骨小梁結構、縮小骨小梁及骨髓腔間隙，對恢復去勢大鼠骨質微循環結構有明顯促進作用，從而提高大鼠股骨生物力學特性，增加骨質強度以治療PMOP大鼠。