血清25-(OH)D水平及VDR基因多態性與類風濕性關節炎骨侵蝕的關系探討

魏巍 張偉 吳國志 陳榮

海南醫學院第二附屬醫院，570311

類風濕性關節炎是以炎性滑膜炎反應為主的系統性、自身免疫性疾病，常可在發病2年內出現骨關節破壞，導致患者殘疾，嚴重影響日常生活[1]。維生素D是一種類固醇衍生物，其通過與維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)相結合，可參與機體鈣磷代謝及骨鹽沉積，并可作用于機體免疫系統，影響多種細胞增殖及分化，參與免疫調節[2]。25-羥維生素D[25-(OH)D]是維生素D中間代謝產物，被認為是反映維生素D水平的一個最可靠指標[3]。VDR廣泛分布于機體各組織細胞中，其可參與骨代謝及免疫調節反應。有研究發現[4]，參與骨代謝的VDR基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點主要為FokI、BsmI及ApaI等。類風濕性關節炎發病機制復雜。有研究表明[5]，維生素D缺乏可加速類風濕性關節炎產生及惡化。但目前國內關于維生素D水平及其受體基因多態性與類風濕性關節炎骨侵蝕關系的研究尚少，基于此，本研究通過檢測類風濕性關節炎患者血清25-(OH)D水平及VDR基因多態性，并分析其與骨侵蝕的相關性，以期為臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將本院2014年7月至2018年6月收治的94例類風濕性關節炎患者設為研究組，另將85例同期體檢健康者設為健康組。其中研究組男35例，女59例，漢族，年齡34～62歲，平均(46.28±7.21)歲，病程4～32個月，平均(20.12±3.34)個月，受累關節數5～23個，平均(14.26±2.13)個，改良28關節疾病活動性評分(DAS28)[6]3.89～5.96分，平均(5.35±0.38)分；健康組男34例，女51例，漢族，年齡32～65歲，平均(47.93±7.45)歲。2組受試者在民族、性別及年齡方面差異無統計學意義(P>0.05)，且本研究獲得醫院倫理委員會批準。

納入標準：研究組均符合類風濕性關節炎診斷標準[7]，均經X線檢查；近3個月內均未接受維生素D類似物治療；所有受試者均知情同意，且均為漢族。

排除標準：合并骨質疏松以及其他與骨侵蝕有關疾病者；腫瘤、感染等引起關節疼痛者；不能正常飲食或不能接受戶外陽光照射者；存在血緣關系者。

1.2 方法

1.2.1血清25-(OH)D水平檢測：均抽取受試者清晨空腹靜脈血3 mL，離心，分離血清，采用酶聯免疫吸附試驗法檢測血清25-(OH)D水平(試劑盒購于英國艾迪斯公司)，所有步驟嚴格按照說明書執行。

1.2.2VDR基因多態性檢測：⑴血樣DNA提取：采集受試者靜脈血4 mL，根據Wizard Genonic DNA purification Kit(Promega公司)試劑盒說明書進行操作，提取DNA并經分光光度計定量及瓊脂糖凝膠電泳質檢；⑵引物設計與合成：選擇3個VDR基因SNPs位點，即FokI(rs2228570)位點、BsmI(rs154410)位點、ApaI(rs7975232)位點，參照Mosaad等[9]設計的用于VDR基因擴增引物，由北京奧科生物公司合成；⑶基因型檢測：采用MassARRAY分子量陣列技術平臺，通過引物延伸或切割反應與MALDI-TOF質譜技術相結合，而對所選VDR基因SNPs位點分型進行檢測，獲得分型結果。

1.2.3骨侵蝕分期：根據經雙手X線片檢查分期(任意一個受累關節)[8]，Ⅰ期：無骨質破壞性改變或關節端骨質疏松；Ⅱ期：骨質疏松、可有輕度軟骨破壞、伴或不伴輕度軟骨下骨質破壞，可伴有關節活動受限但無關節畸形等；Ⅲ期：骨質疏松伴軟骨破壞，明顯關節軟骨下囊樣破壞，關節半脫位，關節間隙狹窄等；Ⅳ期：除了包含Ⅱ、Ⅲ期內容外，且有纖維性或骨性強直；其中Ⅰ期與Ⅱ期歸為無骨侵蝕(25例)，Ⅲ期與Ⅳ期歸為有骨侵蝕(69例)。

1.3 觀察指標

研究組與健康組血清25-(OH)D水平：其中<20 ng/mL記為缺乏，≥20 ng/mL且<30 ng/mL記為不足，≥30 ng/mL且≤100 ng/mL記為正常。研究組骨侵蝕者與無骨侵蝕者血清25-(OH)D水平。研究組與健康組基因型、等位基因分布：缺乏內切酶FokI、BsmI、ApaI酶切位點用F、A、B表示，存在酶切位點用f、a、b表示。研究組骨侵蝕者與無骨侵蝕者基因型、等位基因分布。

1.4 統計學方法

采用SPSS 25.0統計學軟件對數據進行分析，兩樣本計量資料與計數資料分別采用t檢與χ2檢驗，血清25-(OH)D水平、VDR基因多態性與骨侵蝕關系探討采用Logistic多元逐步回歸模型進行分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究組與健康組血清25-(OH)D水平比較

研究組血清25-(OH)D水平明顯低于健康組(P<0.05)，見表1。

2.2 研究組骨侵蝕與無骨侵蝕者血清25-(OH)D水平比較

研究組骨侵蝕患者血清25-(OH)D水平明顯低于無骨侵蝕者(P<0.05)，見表2。

表1 研究組與健康組血清25-(OH)D水平對比

表2 研究組骨侵蝕與無骨侵蝕者血清25-(OH)D水平對比

2.3 研究組與健康組基因型、等位基因分布比較

研究組BsmI位點基因型頻率及等位基因B頻率與健康組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，研究組FokI位點基因型FF、Ff及等位基因F占比均明顯高于健康組(P<0.05)，研究組FokI位點基因型ff占比明顯低于健康組(P<0.05)，研究組ApaI位點基因型AA、Aa及等位基因A占比均明顯高于健康組(P<0.05)，研究組ApaI位點基因型aa占比明顯低于健康組(P<0.05)，見表3。

表3 各位點基因型和等位基因分布Table 3 Genotype and allele distribution of each locus

續表3 各位點基因型和等位基因分布

2.4 研究組骨侵蝕與無骨侵蝕者基因型、等位基因分布比較

研究組骨侵蝕患者FokI位點、ApaI位點、BsmI位點基因型出現頻率與無骨侵蝕患者差異無統計學意義(P>0.05)，研究組骨侵蝕患者FokI位點、ApaI位點、BsmI位點的等位基因F、B、A出現頻率與無骨侵蝕患者差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 骨侵蝕與無骨侵蝕者各位點基因型和等位基因分布

續表4 骨侵蝕與無骨侵蝕者各位點基因型和等位基因分布

2.5 血清25-(OH)D水平、VDR基因不同SNPs位點基因型與類風濕性關節炎的關系

經Logistic多元逐步回歸模型分析發現，血清25-(OH)D<30 ng/mL、FokI位點基因型FF及Ff、ApaI位點基因型AA及Aa均是類風濕性關節炎發病的危險因素(OR=5.149、4.267、3.013、5.234、5.097，P<0.05)，BsmI位點基因型BB及Bb與類風濕性關節炎發病無明顯關系(OR=1.006、1.002，P>0.05)，見表5。

表5 血清25-(OH)D水平、VDR基因不同SNPs位點基因型與類風濕性關節炎的關系

2.6 血清25-(OH)D水平、VDR基因不同SNPs位點基因型與類風濕性關節炎骨侵蝕的關系

經Logistic多元逐步回歸模型分析發現，血清25-(OH)D<20 ng/mL是類風濕性關節炎骨侵蝕的危險因素(OR=3.987，P<0.05)，FokI位點基因型FF及Ff、BsmI位點基因型BB及Bb、ApaI位點基因型AA及Aa均與類風濕性關節炎骨侵蝕無明顯關系(OR=1.007、1.009、1.003、1.001、1.011、1.012，P>0.05)，見表6。

表6 血清25-(OH)D水平、VDR基因不同SNPs位點基因型與類風濕性關節炎骨侵蝕的關系

3 討論

類風濕性關節炎的發病可能與遺傳、多種免疫因素等有關，其病理變化主要為間質大量炎性細胞浸潤、滑膜襯里細胞增生以及骨和軟骨組織破壞等[10]。骨侵蝕患者的骨關節損傷不可逆，故早期診斷及干預極其重要。X線檢查是臨床診斷類風濕性關節炎骨侵蝕的常用手段，但經X線檢查顯示異常者多已出現不可逆骨關節破壞，嚴重影響疾病恢復[11]。

本研究發現，研究組血清25-(OH)D水平低于健康組(P<0.05)，且骨侵蝕患者低于無骨侵蝕者(P<0.05)。另分析發現血清25-(OH)D<30 ng/mL是類風濕性關節炎發病的危險因素，血清25-(OH)D<20 ng/mL是類風濕性關節炎骨侵蝕的危險因素，提示類風濕性關節炎患者血清25-(OH)D水平降低，且在伴骨侵蝕患者中降低更加明顯，血清25-(OH)D水平缺乏可增加骨侵蝕發生風險。維生素D是骨正常鈣化及礦物質代謝所必需的，可促進骨形成，而血清25-(OH)D是維生素D的活性形式，其水平的降低表明維生素D減少[11]。有研究顯示[12]，T、B淋巴細胞以及其相關細胞因子在類風濕性關節炎發生發展中發揮重要作用。維生素D是抑制胸腺基質樹突狀細胞分化成熟的主要因子，可直接作用于Th1、Th2及Th17細胞，減少炎性細胞因子分泌，并促進抗炎細胞合成[14]。因此，維生素D既可改善關節骨質破壞，亦具有免疫抑制作用。當25-(OH)D水平降低，則維生素D調節骨骼及鈣磷代謝作用減弱，影響關節骨質破損的修復，且免疫抑制功能下降，炎性反應加重，則病情進一步發展，關節損傷程度加重[15]。有研究發現[16]，類風濕性關節炎患者血清25-(OH)D水平越低，其關節破壞程度越嚴重，此與本研究結果相符合。因此，類風濕性關節炎患者血清25-(OH)D水平減低，且其缺乏可增加骨侵蝕發生風險。

本研究還發現，研究組FokI位點基因型FF、Ff與等位基因F以及ApaI位點基因型AA、Aa與等位基因A頻率均明顯高于健康組(P<0.05)，研究組基因型ff、aa占比均明顯低于健康組(P<0.05)，且分析發現FokI位點基因型FF及Ff、ApaI位點基因型AA及Aa均是類風濕性關節炎發病的危險因素，提示類風濕性關節炎發病可能與VDR基因FokI位點等位基因F、ApaI位點等位基因A有關?；蚨鄳B性可改變VDR mRNA表達水平，進而在轉錄水平上影響VDR蛋白表達，促使VDR蛋白在數量及活力上出現不同，影響維生素D發揮效應[17]。VDR是糖皮質激素、甲狀腺激素等受體基因超家族成員，存在多個SNPs位點，不同基因型的VDR可對維生素D產生不同的生物效應[18]。本研究還發現，研究組骨侵蝕患者FokI位點、ApaI位點、BsmI位點基因型等級分布及等位基因出現頻率均與無骨侵蝕患者差異無統計學意義(P>0.05)，且分析發現其均與類風濕性關節炎骨侵蝕無明顯關系，提示VDR基因多態性與類風濕性關節炎骨侵蝕的發生風險無關。

綜上，類風濕性關節炎患者血清25-(OH)D水平降低，且其缺乏可增加類風濕性關節炎骨侵蝕發生風險，另VDR基因FokI位點等位基因F及ApaI位點等位基因A雖可增加類風濕性關節炎發病風險，但與骨侵蝕無關。臨床工作者需及早監測類風濕性關節炎患者血清25-(OH)D水平并適時補充維生素D，另需提高對含VDR基因FokI位點等位基因F及ApaI位點等位基因A者的警惕。但本研究樣本量較小，可能會導致實驗結果出現偏差，后續需擴大樣本量進行相關性研究。