一株產香酵母菌的篩選及應用于發酵饅頭的研究

張亭妍，王宏雁，劉鐘棟

（河南工業大學化學化工學院，河南鄭州 450001）

在中國，饅頭成為人們的主食已經流傳許久[1]，至今約有一千多年的時間。傳統老酵子作為發酵劑制作的饅頭一直受人們喜愛。老酵子是混合的發酵劑，里面含有大量的菌種，其中酵母菌起主要發酵作用，這些菌種能夠在面團發酵時通過自身進行酯化反應等反應，使面團擁有獨特的風味口感[2]。由于傳統老酵子多來自于民間農家儲存方法，其中不乏含有一些雜菌影響饅頭的風味和口感[3]。因此，可將傳統老酵子中分離出的菌株進行篩選，從而獲得發酵性能較強、產香性能高的酵母菌株。

在以往關于酵子發酵產香的菌種的研究中，付娜等[4]對篩選出的酵母菌菌株進行分子鑒定和揮發性物質分析；黨輝等[5]對從酵子饅頭中分離得到的3株酵母的發酵性能分析；馬榕燦等[6]對多種酵母的生長和對面團發酵特性差異進行研究。然而目前對分離篩選出產香性能高的酵母菌株應用于饅頭生產工業中揮發性物質成分的差異分析鮮有相關報道。因此，本研究從傳統老酵子中篩選出活性和產香較好的酵母菌，對其進行分子生物學鑒定和生長條件優化，利用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法對添加產香酵母發酵饅頭和未添加產香酵母饅頭中揮發性物質進行定量定性分析，可作為提高工業生產饅頭風味口感的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

傳統老酵子：河南省南陽市市售；高筋小麥面粉：河南龍騰面粉有限公司；活性干酵母：廣東梅山馬利酵母食品有限公司。

1.1.2 化學試劑

蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、瓊脂（均為生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司；酵母基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、DL2000 DNA Marker：天根生化科技有限公司；TaqDNA聚合酶：廣東盛東科技有限公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）：北京智杰方遠有限公司；生物染色液試劑：福建海標有限公司。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養基：蛋白胨8 g，酵母提取物4 g，葡萄糖8 g，蒸餾水400 mL。

YPD固體培養基：向YPD液體培養基中加入8 g瓊脂。將上述培養基放置在120 ℃滅菌25 min。

1.2 儀器與設備

HZQ-X10型恒溫培養箱：紹興市景邁儀器設備有限公司；ABI9700聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：康力生物科技有限公司；THZ-24空氣浴恒溫搖床：金壇區金城春蘭實驗儀器廠；XSP-8C型電子顯微鏡：上海精密儀器儀表有限公司；ZF-388型全自動凝膠成像分析儀：北京六一儀器廠；DYY-6C型電泳儀：河北聯潤設備有限公司；Implen OD600nm細菌/細胞濃度儀：北京盛科信德有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離純化

稱取0.3 g老酵子將其碾碎后，溶于無菌水中用滅菌玻璃棒攪勻20 min，使其基本溶解，加入200 mL YPD液體培養基中28 ℃、180 r/min培養24 h，取上述培養液的上清液2 mL將其稀釋104～106倍后取60 μL均勻涂布于YPD固體培養基上，28 ℃恒溫培養1～2 d，當平板上長出菌落時，挑取單菌落連續劃線傳代培養2～3次得到純化菌株。將得到的純菌株保菌，放于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 產香菌株篩選

初篩：取純化后的菌株以2%的接種量接種于100 mL YPD液體培養基中，在28 ℃恒溫180 r/min搖床培養1～2 d，同時將其劃線接種于YPD固體培養基上在28 ℃條件下培養1～2 d，采用嗅聞法，參考王益姝[7]的方法，通過嗅聞發酵液和固體平板產生的獨特風味，初篩選出產生獨特香氣的酵母菌。

復篩：取上述通過初篩得到的酵母菌的發酵液10 mL于100mL錐形瓶中，再加入10mL蒸餾水，滴加酚酞，用0.1mol/L NaOH標準溶液滴定至顯色后，轉移到10 mL0.1 mol/LNaOH溶液的圓底燒瓶中，水浴加熱皂化回流，取下冷卻至室溫用0.1 mol/L HCl標準溶液滴定至紅色消失，記錄HCl消耗的體積，每株菌發酵液3次平行測定取均值，計算發酵液的總酯含量[8]。篩選出一株總酯含量較高的菌株。

1.3.3 分子生物學鑒定

使用試劑盒提取菌株的DNA，利用真菌通用引物NS1（5'-GTAGTCATATGCTTGTCT-3'）和NS8（5'-TCCGCAGCTTCACCTACGGA-3'）對18S rDNA序列進行擴增。再設置程序95 ℃保持4 min預變性，95 ℃保持30 s變性，55 ℃退火50 s，70 ℃延伸40 s，72 ℃延伸10 min，循環次數為30次進行擴增。用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行分離。將PCR擴增產物樣品委托北京天一輝遠生物有限公司進行DNA一代測序檢測。將菌株的測序結果進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對分析，從GenBank數據庫中搜索選取同源性相似的序列，使用MEGA 7軟件建立酵母菌的系統發育樹。

1.3.4 酵母菌生長曲線的測定

將菌株ZT-01以1%的接種量接種到10 mL YPD液體培養基試管中，28 ℃、180 r/min搖床中培育48 h，設定在波長600 nm處每隔4 h測定樣品的吸光度值（OD600nm值），3次平行取均值，用Origin 2020軟件作圖。

1.3.5 最適生長溫度及最適生長pH的測定

將菌株ZT-01發酵液以1%接種量接種到10 mL YPD液體培養基試管中，調培養基的pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、7.5，于24 ℃、26 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃、40 ℃條件下180 r/min恒溫振蕩培養28 h，在波長600 nm處分別測定OD600nm值。

1.3.6 饅頭制作

添加產香酵母饅頭制備：稱取0.3 g活性干酵母將其加入100 mL無菌水中攪拌均勻，取篩選得到的一株產香酵母以2%的接入量添加到活性干酵母溶液中，攪拌均勻后倒入稱好的面粉中（面粉和水比例2∶1），放入和面機中和面成型，放入恒溫恒濕箱中醒發2 h左右（溫度35 ℃，相對濕度80%）。直到成型的饅頭體積膨大為原來的1倍左右。放入蒸鍋中蒸熟后取出。未添加產香酵母饅頭制備方法同上。

1.3.7 香氣成分GC-MS 分析

酵母饅頭香氣成分GC-MS分析。頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction gas chromatography，HS-SPME）條件：取5 g樣品放入固相微萃取樣品瓶中，萃取溫度為85 ℃，轉速為600 r/min，萃取時間為40 min，再放入氣相色譜進樣口解吸6 min（溫度200 ℃）。

氣相色譜條件：色譜柱為HP-5（30 m×0.53 mm×5 μm）；載氣為高純氦氣（He）（純度＞99.999%），柱溫50 ℃，保持時間10 min，以2 ℃/min速度持續加熱升溫直至250 ℃，保持20 min。質譜條件：電離方式為電子電離（electronic ionization，EI）源；離子源溫度200 ℃；電子能量70 eV；掃描范圍50～800 m/z。根據所得GC-MS總離子流圖上的峰值，檢索美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）-08數據庫得到其對應的物質，計算出各種香氣成分的相對含量（%）。

2 結果與分析

2.1 產香酵母菌的初篩

由表1可知，從老酵子中篩選出5株產香酵母菌株，分別編號為ZY-01、ZY-02、ZY-03、ZY-04、ZY-05，5株菌株呈現不同的菌落數量、產香強度和風味特征，菌株ZY-01、ZY-02液體培養和固體培養產生較濃烈的酯香和酒香，菌落數量生長數量較多，說明菌株ZY-01和ZY-02的生長活性較高且產香性能較好。菌株ZY-03、ZY-04、ZY-05液體培養和固體培養具有淡淡的果香和酯香其風味較弱，菌落數量生長數量較少，說明菌株ZY-03、ZY-04、ZY-05的生長活性較低且產香性能較差。

表1 篩選菌株初篩結果Table 1 Primary screening results of screened strains

2.2 產香酵母菌的復篩

由圖1可知，5株菌株的總酯含量高低不同，其中菌株ZY-01的發酵液中總酯含量最高為355.2 mg/L。綜合初篩和復篩結果，選擇菌株ZY-01作為產香菌株進一步研究。

圖1 篩選菌株復篩結果Fig.1 Secondary screening results of screened strains

2.3 菌株ZY-01形態觀察

菌株ZY-01菌落及細胞形態觀察結果見圖2。由圖2A可知，在YPD固體培養基上的菌落的體形態特征大多為白色圓型，質地均勻，菌落表面光滑呈不透明狀，粘稠并散發出發酵的香氣。由圖2B可知，涂片滴加結晶紫染色劑染色細胞，在100×顯微鏡下觀察，酵母細胞為紫色多呈橢圓形。

圖2 菌株ZY-01的菌落形態（A）和細胞形態（B）Fig.2 Colony morphology (A) and cell morphology (B) of strain ZY-01

2.4 菌株ZY-01分子生物學鑒定

2.4.1 酵母菌的PCR擴增結果

將選取的菌株ZY-01進一步使用分子生物學方法進行鑒定，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA，結果見圖3。由圖3可知，菌株ZY-01 PCR擴增產物在500～750 bp之間有一條清晰的亮帶，從而得到了菌株ZY-01的18S rDNA堿基長度。

圖3 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR product

2.4.2 序列分析結果

菌株ZY-01 18S rDNA系統發育進樹結果見圖4。由圖4可知，菌株ZY-01與NCBI同源序列對比結果可知Wickerhamomyces anomalusstrain DBF29（KT207259.1）的親緣關系最近，序列的相似度達到99%。結合圖3結果，菌株ZY-01被鑒定為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。

圖4 菌株ZY-01基于18S rDNA序列PCR擴增產物的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain ZY-01 based on 18S rDNA sequence PCR amplification products

2.5 菌株ZY-01生長特性分析

2.5.1 菌株ZY-01的生長曲線的測定

圖5 菌株ZY-01生長曲線Fig.5 Growth curve of strain ZY-01

由圖5可知，菌株在0～8 h為遲緩期，生長緩慢且時間較短；經過遲緩期后，12～28 h為對數生長期，此時期時間較長，菌株生長速率最大，代謝速率最旺盛；在28 h時OD600nm值上升至1.75，此時達到最大，菌株在28～48 h為穩定期，在這期間隨時間的不斷延長OD600nm值基本保持大致穩定，穩定期內菌株ZY-01 OD600nm值基本都在1.70～1.75。

2.5.2 菌株ZY-01的最適生長溫度及最適pH的測定

圖6 溫度（A）及pH值（B）對菌株ZY-01生長的影響Fig.6 Effect of temperature (A) and pH value (B) on strain ZY-01 growth

由圖6A可知，在不同溫度條件下菌株ZY-01的生物量變化呈現先上升后下降的趨勢。在24～28 ℃時，菌株ZY-01生物量持續上升，并在溫度為28 ℃時達到最高，OD600nm值為1.82；溫度在28～36 ℃時，菌株ZY-01生長受到了明顯抑制；當溫度＞36 ℃之后，酵母菌的生物量急劇下降，這是由于隨著的溫度升高，菌體出現了自溶現象致使酵母菌生長量減少[9-10]。因此，菌株ZY-01最適溫度為28 ℃。

由圖6B可知，在不同pH條件下OD600nm的生物量呈現出先上升后平緩的趨勢。當pH值為3.0～4.0時，菌株ZY-01的OD600nm值迅速增加；當pH值為4.0～7.5時，菌株ZY-01的生長穩定，說明菌株ZY-01在pH值為4.0～7.5范圍內生長良好。因此，菌株ZY-01的最適pH值為4.0。

2.6 產香酵母應用于發酵饅頭研究

采用GC-MS法分析添加產香酵母發酵饅頭和未添加產香酵母發酵饅頭中的風味物質的種類和相對物質含量分析結果比較見表2。

表2 兩種饅頭主要風味物質種類和含量GC-MS分析比較Table 2 Comparison of main flavor substance types and contents in two kinds of Mantou analysis by GC-MS

由表2可知，添加產香酵母發酵饅頭中主要檢測出物質含量較高的風味物質16種，未添加產香酵母發酵饅頭中主要檢測出物質含量較高的風味物質12種，其中兩者共同檢測出12種風味物質，最主要的成分為醇類、酯類、酸類、醛類和酮類化合物，添加產香酵母發酵饅頭中含有醇類6種，酯類5種，酸類2種，醛類1種，酮類2種，未添加產香酵母發酵饅頭含有醇類5種，酯類3種，酸類2種，醛類1種，酮類1種。添加產香酵母發酵饅頭相比未添加產香酵母發酵饅頭：醇類增加11.27%，酯類增加8.85%，酸類減少10.87%，醛類增加1.03%，酮類增加1.16%。添加產香酵母發酵饅頭中醇類和酯類物質的種類和物質含量相比未添加產香酵母饅頭物質含量顯著增加（P＜0.05），醛類和酮類物質種類和物質含量增加差異不顯著（P＞0.05），酸類物質含量顯著減少（P＜0.05）。

由表2可知，添加產香酵母發酵饅頭和未添加產香酵母饅頭發酵產生的主要香氣成分物質有乙醇、異戊醇、苯乙醇、糠醇、丙三醇、乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、γ-丁內酯、苯乙醛和4-羥基-2-環戊烯-1-酮。添加產香酵母發酵饅頭相比于未添加產香酵母饅頭以上物質含量增幅均有較大變化。由此可得出，產香酵母菌對饅頭的風味物質產生了顯著且有利的影響。乙醇具有酒香味和刺激性氣味，苯乙醇具有清新的花香味，可作為食用香精，丙三醇又稱作甘油，該物質具有暖甜味可作為甜味劑和保濕物質。糠醇具有香味可用作食品用香料。乙酸乙酯有甘甜的酒味和水果的清香。γ-丁內酯都具有特殊的芳香氣味。乙酸苯乙酯具有花粉的蜂蜜香氣和蘋果樣的果香[11]。苯乙醛具有水仙花香氣，低濃度時具有櫻桃香味[3]。4-羥基-2-環戊烯-1-酮有糖漿味和焦甜味。除此之外只在添加產香酵母發酵饅頭中檢測到而未添加產香酵母饅頭沒有檢測到的4種香氣物質分別為1-辛烯-3-醇、辛酸乙酯、丁酸異戊酯和苯乙酮。1-辛烯-3-醇有玫瑰花香味和清甜的甘草味[12]。辛酸乙酯具有香甜酒類香氣可作為食品添加劑香料[13-16]。丁酸異戊酯具有強烈的香蕉香氣味[17]。苯乙酮具有山楂的香氣[18]。醇類閾值較高，在饅頭中含量較高是饅頭風味組成的重要成分。酯類、醛類和酮類閾值較低[19-20]，雖然在饅頭中含量較低也能使饅頭具有較強香氣。添加產香酵母發酵饅頭相比未添加產香酵母發酵饅頭增加了香氣物質種類和含量，這些香氣賦予了饅頭獨特的香氣且對風味的貢獻較大。這也是添加產香酵母發酵饅頭風味口感優于未添加產香酵母發酵饅頭的重要因素。

3 結論

通過從傳統老酵子中分離出的ZY-01菌株進行分子生物學鑒定和生長特性研究，結果表明，經鑒定ZY-01菌株為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。菌株ZY-01發酵液的最優生長條件：生長時間為28 h，溫度為28 ℃，pH值為4.0。經GC-MS分析對添加產香酵母發酵饅頭和未添加產香酵母發酵饅頭中揮發性成分種類和含量進行檢測，結果表明，兩者發酵液的揮發性物質中共同的主要香氣成分物質有乙醇、異戊醇、苯乙醇、糠醇、丙三醇、乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、γ-丁內酯、苯乙醛和4-羥基-2-環戊烯-1-酮，除此之外只在產香酵母發酵饅頭中檢測到1-辛烯-3-醇、辛酸乙酯、丁酸異戊酯和苯乙酮這4種香氣物質。添加產香酵母發酵的饅頭與未添加產香酵母發酵饅頭相比醇類、酯類物質含量分別增加11.27%、8.85%。這些香氣賦予了饅頭獨特的風味口感，這也是添加產香酵母發酵饅頭風味口感優于未添加產香酵母發酵的饅頭的重要因素。