影響濃香型白酒醉酒程度的風味物質特異性分析

徐佳楠，皇甫潔，劉 薇，倪永培，董建輝，項興本，王少磊，韓興林，王德良，3*

（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.中國食品發酵工業研究院有限公司，北京 100015；3.科技部國家酒類品質與安全國際聯合研究中心，北京 100015；4.安徽迎駕貢酒股份有限公司，安徽六安 231300）

白酒是中華民族的瑰寶，發展歷史悠久，釀造工藝精湛，風味眾多且風格獨特，有促進人際關系、放松身心、增強抵抗力[1]、促進機體新陳代謝和預防肝癌[2]的功效。研究表明，適量飲酒不但能夠調節和幫助體內生理代謝，還能預防動脈粥樣硬化、降低心血管疾病以及糖尿病的發生和死亡[3-6]。吳壽嶺等[4]研究發現，適度飲酒不僅可以降低男性糖尿病心腦血管的發生，還可以減少腦梗死亡。石亞林等[7]測定了不同香型白酒的體外抗氧化能力，并對不同香型白酒的清除能力進行排序，研究推斷酚類是引起白酒具有抗氧化活性的主要物質成分。劉銀等[8]證實了適量飲酒能夠調節人體對于酯類的分解。岳元媛等[9]討論了白酒中的微量風味物質和金屬元素等健康因子的研究近況。霍嘉穎等[10]闡述了白酒中健康因子的功效。由于白酒起源于中國，發展于中國，國外酒精飲料多以紅酒、香檳、啤酒為主，有關白酒的研究還很匱乏。

隨著社會發展和生活質量的提高，越來越多的消費者開始注重飲酒中和飲酒后的感受。目前，有關白酒醉酒上頭的研究有很多，但是具體造成不適的物質成分、形成機理和調控手段還未明確。在眾多影響醉酒程度的因素中，高級醇含量不合理是導致飲酒醉酒上頭比較常見的原因之一。高級醇是含有三個以上碳原子的醇，包括異戊醇、異丁醇、正丙醇和活性戊醇等。雖然高級醇在人體內的氧化速率沒有乙醇快[11]，但它停留的時間比乙醇長，對人體的麻醉作用也比乙醇高出很多[12]。適量的醇類有益于白酒風味的形成，與酸類酯化后會形成高碳酸酯，使白酒更加芳香舒適；當白酒中的高級醇含量超過一定限度時，會使白酒的口感變得苦澀，從而影響白酒的感官質量，還會抑制神經中樞，出現頭暈和頭痛等癥狀，更嚴重的會導致神經系統充血。

血液中與醉酒程度和飲后“上頭”相關的主要生物標志物是乙醇和乙醛。人體攝入酒精后，含有乙醇的血液流經肝臟后，其中的乙醇首先被乙醇脫氫酶（alcoholdehydrogenase，ADH）氧化為乙醛，該過程中會導致血液中乙醛的累積。乙醛再經乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）作用將自身中的兩個氫原子脫掉，并轉化為乙酸，最終乙酸經三羧酸循環代謝為二氧化碳和水[13]。此外，肝臟中的乙醇還能被CYP2E1酶分解代謝[14]。乙醛的代謝速率主要取決于人體內ALDH含量，其具有較大的個體差異[15]，并與遺傳因素密切相關[16]。這也就意味著只要ALDH的活性較強，就能較快分解乙醛，從而使體內的系統和組織較少受到酒精的影響，即使在飲用一定量的酒后，也不會產生較大反應。雖說在人體內都存在ADH并且在正常個體間含量相差不大，但是ALDH的含量則不盡相同[17]。因此，在體外模擬酒精在人體內的代謝過程，建立體外酶學模型是非常有研究意義的。

因此，本實驗通過對幾款市售濃香型白酒飲后動物行為學和酒精代謝生物標志物的研究，結合酒體成分分析影響飲后不適的高級醇類物質，再由體外酶學實驗探究其對ALDH的影響。以期為提高白酒飲用舒適度，降低醉酒度，減少濃香型白酒中高級醇類物質帶來的上頭效應提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗樣品和動物

實驗選用八款不同濃香型白酒，根據酒精度數的高低分為：高度數組和低度數組。高度數組：酒樣A（52%vol）；酒樣B（52%vol）；酒樣C（52%vol）；酒樣D（52%vol）；對照組：酒樣E（食用酒精52%vol）。低度數組：酒樣F（42%vol）；酒樣G（42%vol）；酒樣H（40.6%vol）；酒樣I（41%vol）；對照組：酒樣J（食用酒精40.6%vol）。

昆明鼠：雄性，四月齡，平均體質量按照30 g/只計算，無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級，實驗前于清潔Ⅱ級環境進行一周適應性飼養。喂養環境為國家規定普通研究及試驗環境（室內溫度18～26 ℃，相對濕度50%～70%，光照150 lx，噪音＜60 dB，室內用排風扇通風換氣，保證室內氨濃度＜14 mg/m3，所喂顆粒飼料達到國家試驗動物營養需要標準，飲用水為符合城市衛生標準的普通自來水，自動飲水器供水），正常飼喂一周后開始實驗。

1.1.2 化學試劑

乙醛脫氫酶（1.5 U/mg）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）：SIGMA（上海）貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

曠場實驗動物行為學跟蹤系統（ANY-Maze系統）：美國Stoelting公司；Clarus 580氣相色譜（gas chromatograph，GC）儀（配備氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，FID））、Clarus SQ 8氣質聯用儀：美國PerkinElmer公司；Scientific Forma 900超低溫冰箱、Multiskan FC酶標儀：美國熱電公司；DHG-9162電熱恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；ICS-3000型離子色譜儀（配有EluGen Cartridge 淋洗液自動發生器、電導檢測器和Chrromeleon 6.80色譜工作站）、Ionpac AS11-HC型分離柱（250 mm×4 mm）、Ionpac AG11-HC型保護柱（50 mm×4 mm）：美國Dionex公司；Multiskan FC型酶標儀：美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 灌胃劑量

由于各酒樣酒精度差異依據酒精密度與百分含量對照表（20 ℃），低度數組酒樣的最低酒精度數為40.6%vol，將低度數組的酒樣統一調為40.6%vol，高度數酒樣酒精度為52%vol，進行密度折算，每只小鼠按照平均體質量30 g計，成年男性的標準體質量設為70 kg。依據《藥理實驗方法學》[18]，按單位體質量的劑量計算，灌胃劑量及對應的人的飲酒量折算如表1所示。高度數組小鼠灌胃量為0.45 mL/只，低度數組小鼠灌胃量為0.60 mL/只。

表1 體質量30 g小鼠的灌胃劑量計算Table 1 Calculation of intragastric dose in mice weighed 30 g

1.3.2 曠場實驗方法

高度數組和低度數組共10個酒樣，每個酒樣隨機灌胃20只小鼠，共計20個平行重復。然后，將每組小鼠依次在灌酒前0 h、灌酒后1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、24 h置于動物精細行為學分析裝置曠場中，采用高頻攝像機和行為學分析軟件Any-maze分別實時錄制小鼠在上述7個時刻時自由運動120 s的行為軌跡，并同步自動分析獲得行為參數。操作過程中保持安靜，每只動物實驗結束后及時清理糞便，使用體積分數為72%醫用乙醇溶液擦拭干凈，減少之前動物的氣味，防止行為干擾。

1.3.3 動物血漿乙醇及乙醛含量測定

將50只小鼠隨機分為10組，每組對應一個酒樣，做5個平行。灌胃后，向離心管加入30 μL肝素鈉（1 500 U/mg），分別于灌酒前0 h和灌酒后第2、5、24 小時，采用斷尾取血采集小鼠血液標本0.3 mL，混勻后于離心機中3 500 r/min離心10 min取上清，即為血漿，所采集樣品均于-80 ℃進行儲存，待測。

參照使用氣相色譜法對血漿中的乙醇、乙醛含量進行測定。配制乙醇、乙醛混合標準工作液，得出乙醛和乙醇的峰面積標準曲線，待測樣品峰面積對照標準曲線回歸方程計算乙醛和乙醇含量。

1.3.4 酒體成分檢測方法

酯、醇、醛測定采用氣相色譜法。色譜條件如下：載氣為氮氣（N2）；流速1 mL/min；氫火焰離子檢測器（FID）（280 ℃）；氫氣（H2）45 mL/min；空氣450 mL/min；CP-Wax 57 CB毛細管柱（0.25 mm×0.20 μm×50 m）。進樣器溫度：240 ℃。采用內標法，內標物選用2%叔戊醇、2%乙酸正戊酯、2%2-乙基丁酸。采用10∶1分流比進樣。

酯測定采用氣質聯用法。氣相色譜條件：載氣為高純氦氣（He）（純度＞99.999%），流速1 mL/min；柱溫：起始溫度35 ℃，恒溫2 min，以4 ℃/min升溫至230 ℃，恒溫7 min；不分流進樣；進樣口溫度240 ℃。質譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，溫度230 ℃；傳輸線溫度240 ℃；電子能量70 eV；掃描范圍：30～550 amu。

有機酸測定采用離子色譜法。色譜條件如下：Dionex IonPao AG11-HC分析柱（4 mm×250 mm）；Dionex IonPao AG1I1-HC保護柱（4 mm×50 mm）；淋洗液：超純水；淋洗液流速1.1 mL/min；進樣體積50 μL；色譜池溫度35 ℃；柱溫30 ℃；抑制器電流96 mA。

1.3.5 主成分分析法

主成分分析法（principal component analysis，PCA）是用降維的思想，將多個變量轉化成為少數的幾個綜合的變量，稱為主成分。這些主成分不僅可以反映原始變量的大部分信息內容，而且它們包含的信息彼此之間沒有重復。

1.3.6 體外酶學實驗方法

實驗原理：乙醛與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）（輔酶Ⅰ）在乙醛脫氫酶的作用下變成乙酸和NADH（還原型輔酶Ⅰ），NADH在波長340 nm下有吸收峰。

根據實驗酒樣中異戊醇和正丙醇質量濃度分別為58～272 mg/L和74～404 mg/L，配制質量濃度分別為19 mg/L、39 mg/L、78 mg/L、167 mg/L、312 mg/L的異戊醇，31 mg/L、62 mg/L、125 mg/L、250 mg/L、500 mg/L的正丙醇，并將其分別加入52%vol食用酒精+300 mg/L乙醛中。

200 μL反應體系：90 μL 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS），10 μL 0.4 mol/L二硫代蘇糖醇（dithiothreitol，DTT），55 μL 4 mmol/L NAD+，30 μL 0.9 U/mL ALDH，15 μL 52%vol食用酒精+300 mg/L乙醛+高級醇。

操作步驟：將酶標儀提前預熱30 min，乙醛脫氫酶液提前取出放置30 min，按照順序依次向酶標孔板加樣，然后將孔板于37 ℃保溫箱孵育5 min后，在波長340 nm處測定吸光度值。以吸光度值為縱坐標，乙醛脫氫酶活力為橫坐標，繪制乙醛脫氫酶標準曲線。

1.3.7 數據處理

實驗結果采用Excel 2016、SPSS 23.0軟件對數據進行分析，并使用Qrigin8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 曠場實驗結果

曠場實驗是用來檢測小鼠在曠場中的自發活動和探索行為的經典動物學實驗[19]。常用的曠場系統是一個圓形的箱子，頂部裝有連接電腦的攝像頭，通過軟件記錄分析小鼠在曠場中的行動軌跡，行動距離、移動時間、停滯時間等參數。行為參數比是灌胃后小鼠在曠場中運動120 s的行為參數/灌胃前小鼠在曠場中運動120 s的行為參數[20]。灌胃后，不同時刻小鼠在曠場中的行動距離見分別表2和表3。由行為參數計算行為參數比，可以減少小鼠自身原因造成的誤差，結果如圖1～3所示。

表2 高度數組小鼠在曠場中運動的行動距離Table 2 Movement distance of mice with high alcohol dose in the open field

由表2可知，各組小鼠在灌胃后第4、5小時行動距離處于低谷，A組小鼠在灌胃后第3小時與對照組E差異顯著（P＜0.05）；B組小鼠在灌胃后第1、3小時與對照組差異顯著（P＜0.05），在灌胃后第2小時與對照組差異極顯著（P＜0.01）；C組小鼠在灌胃前0 h和灌胃后第3、4小時，行動距離與對照組差異顯著（P＜0.05），在灌胃后第2小時與對照組差異極顯著（P＜0.01）；D組小鼠在灌胃后第2、24小時與對照組差異顯著（P＜0.05），在灌胃后第24小時恢復力最好。

由表3可知，除F組小鼠在灌胃后第1小時行動距離增加，其他組小鼠灌胃后行動距離都降低，行動能力減弱。其中，F組小鼠在灌胃后第1、2小時行動距離與對照組J差異顯著（P＜0.05）；G組與對照組無顯著性差異（P＞0.05）；H組小鼠行動距離在灌胃后第3、25小時與對照組有顯著性差異（P＜0.05）；I組小鼠行動距離在灌胃后第3小時與對照組有顯著性差異（P＜0.05）。

表3 低度數組小鼠在曠場中運動的行動距離Table 3 Movement distance of mice with low alcohol dose in the open field

圖1 不同時刻小鼠在曠場中運動的行動距離比Fig.1 Ratio of movement distance of mice in the open field at different time

由圖1～3可知，A組小鼠灌胃后3 h前行動距離比值＞1，3 h后行動距離比值＜1，停滯時間比值在2～8之間，有上升趨勢但低于其他組，與對照食用酒精組E無顯著性差異（P＞0.05）。B組小鼠灌胃后5 h內的不同時間點的行動距離比與移動時間比值＜1，停滯時間比值在10～14范圍內，與對照組相比，酒樣B組小鼠行動距離比、停滯時間比差異顯著（P＜0.05）。C組小鼠灌胃后行動距離比與移動時間比值也＜1，停滯時間比值在7～14之間，與對照組差異極顯著（P＜0.01）。D組小鼠灌胃后行動距離比在3 h＞1，然后開始下降，移動時間比值接近1，停滯時間比在2～7之間，與對照組E差異不顯著（P＞0.05）。

F組小鼠飲酒后在1 h時行動距離比值＞1，之后行動距離比值＜1，移動時間比為0.7～1.0，停滯時間比為1～4，與對照食用酒精組J差異顯著（P＜0.05）。G組小鼠灌胃后不同時間點的行動距離比與移動時間比值均＜1，整體比值較低，停滯時間比值在4～11范圍內，與對照組相比，差異不顯著（P＞0.05）。H組小鼠灌胃后行動距離比與移動時間比值也＜1，行動距離比值在3 h、5 h時處于低谷，停滯時間比值在2～12之間，與食用酒精組相比，H組小鼠移動時間比、停滯時間比差異顯著（P＜0.05）。I組小鼠灌胃后行動距離比值與G組相近，移動時間比值為0.6～0.8之間，停滯時間比在6～11范圍內，與食用酒精組比差異不顯著（P＞0.05）。

曠場實驗結果表明，A與B組小鼠飲酒后不同時間點行動距離比、移動時間比、停滯時間比與食用酒精組差異顯著（P＜0.05）；C組小鼠灌胃后不同時間點行動距離比、移動時間比、停滯時間比，與對照食用酒精組相比，差異極顯著（P＜0.01）；D組小鼠行為參數比與食用酒精組相近，差異不顯著（P＞0.05）。F與H組小鼠灌胃后行為參數比與食用酒精差異顯著（P＜0.05）；G與I組小鼠行動距離比、移動時間比、停滯時間比，與食用酒精組相比，差異不顯著（P＞0.05）。綜上，實驗組與對照食用酒精組小鼠在灌胃后不同時刻都會引起行為參數變化，整體表現為行為抑制狀態。其中，酒樣B、C、H飲用后小鼠行動距離比和移動時間比值較低，停滯時間比值較高。

2.2 血漿中乙醇、乙醛含量測定結果

乙醇進入人體后隨血液流經肝臟，首先被乙醇脫氫酶氧化為乙醛，該過程中會導致血液中乙醛的累積。乙醛再被乙醛脫氫酶轉化為乙酸，最終乙酸將被代謝為二氧化碳和水。當血液中乙醇濃度超過一定限度時，血流量增加而代謝作用卻下降。這就造成乙醇在腦中不能及時代謝排出，必然會引起頭痛、頭暈。根據曠場實驗結果，灌胃后2 h與5 h行為參數差異較大，同時在飲后2 h左右血液乙醇累積含量最大，故本實驗選擇測定小鼠灌胃前0 h和灌胃后2 h、5 h、24 h血漿乙醇和乙醛含量，結果分別見表4和表5。

表4 高度數組小鼠血漿乙醇及乙醛含量測定結果Table 4 Determination of ethanol and acetaldehyde in plasma of mice content in the high alcohol group

表5 低度數組小鼠血漿乙醇及乙醛含量測定結果Table 5 Determination of ethanol and acetaldehyde content in plasma of mice in the low alcohol group

由表4可知，小鼠灌胃后2 h，血漿中乙醇的積累程度由高到低分別是D、A、B、C、E（食用酒精）；A、B、D組小鼠血漿乙醇含量與對照食用酒精組E差異顯著（P＜0.05）；C組小鼠血漿乙醇含量與食用酒精差異不顯著（P＞0.05）。灌胃后5 h時，乙醇的積累程度由高到低分別是C、B、A、D、E，其中，C組小鼠血漿中乙醇累積量最高，在灌胃后2～5 h內，乙醇在體內轉化率極低，A、B和C組乙醇含量與對照組差異顯著（P＜0.05）；D組乙醇含量與對照組差異不顯著（P＞0.05）。灌胃后24 h，所有酒樣的血漿乙醇濃度幾乎接近于零，與食用酒精差異不顯著（P＞0.05）。灌胃后2 h，小鼠血漿乙醛含量為2～5 mg/L，由高到低分別是B、D、C、E（食用酒精）、A；5 h時，乙醛含量在1～4 mg/L范圍內，由高到低分別是B、E、D、C、A；其中，B、C、D組小鼠血漿乙醛含量與對照組E無顯著性差異（P＞0.05）；A組與食用酒精差異顯著（P＜0.05）。

由表5可知，灌胃后2 h時，小鼠血漿中的乙醇含量由高到低分別是H、F、I、G、J（食用酒精）；灌胃后5 h時，乙醇含量由高到低分別是I、H、G、J、F；在灌胃后24 h時，所有酒樣的血漿乙醇濃度幾乎接近于零；其中，H 組與食用酒精組差異極顯著（P＜0.01），乙醇累積量最高；F組與食用酒精組差異顯著（P＜0.05）；G、I組乙醇含量與食用酒精組差異不顯著（P＞0.05）。灌胃后2 h、5 h、24 h小鼠血漿乙醛含量逐漸降低，實驗組與對照組食用酒精無顯著性差異（P＞0.05）。

通過對灌胃后小鼠血漿乙醇和乙醛的測量結果可得出，飲用不同的白酒后乙醇和乙醛在體內的代謝速率各有不同。其中，C組小鼠在灌胃后5 h時血漿中乙醇累積量最高，飲酒后2～5 h內，乙醇在體內轉化為乙醛的速率極低，與對照組差異顯著（P＜0.05），H組小鼠在灌胃后2 h時乙醇累積量較其他組高，與對照組差異極顯著（P＜0.01），推測酒體中有其他微量物質成分影響乙醇在體內的代謝速率；小鼠血漿乙醛含量在1～6 mg/L范圍內，隨時間變化逐漸降低；除A組乙醛含量與對照組差異顯著（P＜0.05）外，其他實驗組與對照組差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 酒體成分PCA結果分析

采用氣相色譜法對八款濃香型白酒主要的四種風味物質成分進行定量分析，結果見表6。由表6可知，共檢測出19種酯類、13種高級醇、10種酸類、6種醛類。由于過量的高級醇飲后可造成頭痛，降低飲用舒適度。王維剛等[21]通過對濃香型白酒中高級醇的研究，初步判定異戊醇為飲后不適的關鍵高級醇之一，所以本研究主要以高級醇為研究對象。

表6 八款市售濃香型白酒中醇類物質含量Table 6 Content of alcohols in eight kinds of commercial strong-flavor Baijiu

將八款濃香型白酒所檢測出的醇類物質進行主成分分析，結果見圖4。

圖4 低度數組（A）和高度數組（B）醇類物質主成分分析結果Fig.4 Principal component analysis results of alcohols in low alcohol group (A) and high alcohol group (B)

由圖4 可知，酒樣A和B是以主成分2（PC2）所代表的正丙醇占主要作用；酒樣D的兩個主成分均不起作用；酒樣C是以主成分1（PC1）所代表的甲醇、仲丁醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、正戊醇、正己醇起主要作用。酒樣F和G的兩個主成分均不起作用，酒樣H是以PC1所代表的甲醇、異丁醇、活性戊醇、異戊醇起主要作用；酒樣I中PC2所占權重最大，說明PC2所代表的正丁醇在其所含醇類物質中起到主要作用。

高級醇含量不合理是影響酒體醉酒程度的常見原因之一，高級醇含量過高，會抑制神經遞質的表達，飲酒者次日醒來會出現頭暈、頭痛癥狀。結合曠場實驗和小鼠血漿乙醇、乙醛研究結果表明，酒樣B、C和H能夠引起小鼠飲后較為強烈的不適感。由高級醇含量發現，而酒樣C中的異丁醇、活性戊醇、異戊醇雖然在其所含醇類物質中起到主要作用，但含量較低，說明造成飲后不適的關鍵物質不是高級醇；酒樣H中異戊醇含量最高，酒樣B中正丙醇含量占所有酒樣中最高，由此推斷異戊醇和正丙醇含量過高對濃香型白酒醉酒程度有一定影響。

2.4 酒體成分對乙醛脫氫酶活性影響

以乙醛脫氫酶活力（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制乙醛脫氫酶標準曲線，得到乙醛脫氫酶標準曲線回歸方程y=0.458 7x+0.057 7，相關系數R2=0.998 9，吸光度值隨著酶濃度的升高而升高，確定乙醛脫氫酶濃度為0.9 U/mL合適。將52%vol食用酒精+300 mg/L乙醛中分別加入不同濃度的異戊醇、正丙醇，分別考察其對乙醛脫氫酶酶活的影響，結果分別見圖5。

圖5 不同濃度異戊醇（A）、正丙醇（B）對乙醛脫氫酶酶活的影響Fig.5 Effects of different concentration of isoamyl alcohol (A) and n-propanol (B) on acetaldehyde dehydrogenase activity

由圖5可知，異戊醇質量濃度為20～310 mg/L范圍時，乙醛脫氫酶活力隨著異戊醇濃度的升高而降低。正丙醇質量濃度在30～500 mg/L范圍時，隨著正丙醇質量濃度的升高，乙醛脫氫酶活力降低。

3 結論

通過對八款市售濃香型白酒產品醉酒程度進行研究，結果表明，異戊醇和正丙醇含量過高對濃香型白酒醉酒程度有一定影響。由體外酶學實驗得到驗證，在一定濃度范圍內，隨著異戊醇和正丙醇含量的增加，乙醛脫氫酶活性降低。由此推斷，異戊醇、正丙醇含量過高會降低乙醛脫氫酶活力，使得乙醛在體內累積，從而影響濃香型白酒醉酒程度但是飲酒后，這些微量物質成分在人體內的代謝是一個非常復雜的過程，體外實驗只是一個初步的篩選，還需體內或細胞實驗加以驗證。在理性飲酒的基礎上，對中國白酒的不斷探索和研究，為白酒產品品質提升提供科學支持，對于白酒行業的持續發展能力具有重大意義。