漿細胞樣樹突狀細胞和Foxp3+調節性T細胞在結直腸癌組織中的表達及其意義

王 丹，廖 丹，李 紅，熊立秋，武 瑩，董 營，蓋曉東

(1. 北華大學醫學院病理教研室，吉林 吉林 132013；2. 吉林化工集團公司總醫院急診內科，吉林 吉林 132011)

結直腸癌(colorectal cancer, CRC)是臨床上常見的惡性腫瘤，臨床治療主要是手術治療、內鏡治療及放化療，近年來免疫治療和中醫中藥治療也越來越受到重視。CRC微環境和腫瘤引流淋巴結(tumor-draining lymph node，TDLN)中的各種免疫細胞在抗腫瘤免疫中起至關重要的作用，探討抗腫瘤免疫的作用機制可為臨床CRC的治療提供新線索。

調節性T 細胞(regulatory T cell, Tregs)代表CD4+輔助T細胞亞群，叉狀頭轉錄因子3(forked head transcription factor 3, Foxp3)作為Tregs的標志性分子[1]，是叉狀頭轉錄因子家族成員之一。Foxp3作為一個轉錄調控子能夠調節Tregs的活性，其在調節機體自身免疫中起關鍵作用，Foxp3基因突變能夠引起嚴重的自身免疫性疾病，因此Foxp3在調節機體免疫自穩中起至關重要的作用。在多種人類惡性腫瘤中均發現了Tregs的浸潤，Foxp3+Tregs通過抑制抗腫瘤免疫來促進腫瘤生長和轉移[2]。樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)是一種功能強大的抗原提呈細胞，是啟動和活化靜止T細胞的專職細胞，因此DCs與T細胞的相互作用是腫瘤有效免疫應答的基礎。根據細胞起源不同，DCs可分為髓樣樹突狀細胞(myeloid dendritic cells, mDCs)和漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cells, pDCs)。研究[3]顯示：mDCs和Tregs在免疫應答及免疫耐受過程中起至關重要的調節作用。mDCs在CRC患者組織中的浸潤可以反映腫瘤組織的免疫狀態[4]，但pDCs是否有類似的作用目前尚不明確。pDCs起源于淋巴樣前體細胞，在病毒刺激下能夠分泌大量的Ⅰ型干擾素，促進固有性免疫，在免疫系統中發揮重要的作用。pDCs與T細胞的相互作用可促進Tregs的產生[5]。到目前為止，尚不清楚CRC組織中CD123+pDCs和Foxp3+Tregs是否對CRC 患者的臨床進展和預后有影響。本研究將Foxp3和CD123蛋白在腫瘤組織中的表達水平與CRC患者臨床病理指標進行統計學分析，探討Tregs和pDCs在CRC組織中分布的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 標本收集和處理選擇2008年6月—2015年12月在吉化集團公司總醫院行手術切除并經病理證實的CRC患者63例，患者術前均未經放療或化療。63例CRC患者中男性33例，女性30例，平均年齡64歲(47～82歲)；有淋巴結轉移27例，無淋巴結轉移36例；分化程度良好12例，分化程度較低46例(5例黏液癌不計入)。根據2000年WHO關于CRC的標準分類，管狀腺癌58例，黏液癌5例；根據國際癌癥控制聯盟(UICC 2002)標準分類，T1+T2期19例，T3+T4期44例；根據UICC 2002分期系統的TNM分期標準分類，Ⅰ+Ⅱ期34例，Ⅲ+Ⅳ期29例。收集上述63例CRC患者癌組織和TDLN標本，同時收集癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣>5 cm處)作為對照。本研究方案經北華大學醫學院倫理委員會批準，所有研究對象均對本研究知情同意。

1.2 主要試劑和儀器小鼠抗人Foxp3單克隆抗體(武漢博士德公司)，小鼠抗人CD123單克隆抗體(北京杉木金橋生物技術公司)，多聚賴氨酸、免疫組織化學SP試劑盒和DAB顯色劑(福州邁新生物技術公司)。包埋機和切片機(德國LEICA公司)，生物顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 免疫組織化學染色所有標本經固定、常規脫水和石蠟包埋，制作4 μm厚組織切片，采用SP免疫組織化學試劑盒進行免疫組織化學染色：切片經二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，3% H2O2室溫下孵育阻斷內源性過氧化物酶活性，然后加熱(EDTA, pH值8)誘導抗原修復。切片分別滴加Foxp3抗體和CD123單克隆抗體4℃過夜后滴加二抗，PBS緩沖液沖洗后加入DAB溶液，顯微鏡下觀察控制顯色，蘇木精復染，然后脫水封片。每個樣本重復檢測2次。

1.4 結果判定標準染色組織切片置于400倍顯微鏡下，隨機選取10個視野，分別由不同病理學專業人員采用雙盲法評估觀察結果。每個視野計數100個細胞，計數陽性細胞數，求取陽性細胞數的平均值。陽性細胞數≤ 20為低浸潤，陽性細胞數>20為高浸潤。

2 結 果

2.1 CRC患者癌組織和癌旁正常組織中Foxp3+Tregs和CD123+pDCs陽性細胞數Foxp3蛋白陽性表達為棕黃色顆粒，主要定位于Tregs的細胞核中，Foxp3+Tregs散在分布于CRC患者腫瘤組織和癌旁正常組織中，其在CRC患者癌組織中的陽性細胞數(8.1 ± 2.7)明顯高于癌旁正常組織(1.0 ± 0.6 )(P<0.01)(圖1A，見插頁九)。CRC患者癌組織中CD123+pDC主要分布于腫瘤組織間質(圖1B，見插頁九)，其陽性表達為棕黃色顆粒，主要定位于細胞漿，CD123+pDC以圓形和漿細胞樣形態為特征，盡管其陽性細胞數較低，但是CD123在CRC腫瘤組織中的陽性表達率(44.2%)明顯高于癌旁正常組織(10.0%)，差異有統計學意義 (χ2= 18.68,P<0.01)。

2.2 不同臨床病理特征CRC患者癌組織中Foxp3+Tregs陽性細胞數TNM分期Ⅲ+Ⅳ期患者癌組織中Foxp3+Tregs陽性細胞數明顯高于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期患者(P<0.01)，淋巴結轉移陽性患者癌組織中Foxp3+Tregs陽性細胞數明顯高于無淋巴結轉移患者(P<0.01)，Foxp3+Tregs陽性細胞數與患者年齡、腫瘤類型、腫瘤浸潤深度和腫瘤分化程度無關聯(P>0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征CRC患者癌組織中Foxp3+Tregs陽性細胞數

2.3 mTDLN和mfTDLN組織中Foxp3+Tregs和CD123+pDCs陽性細胞數及pDCs/mDCs比值Foxp3+Tregs分布于淋巴結的副皮質區，mTDLN組織中Foxp3+Trges陽性細胞數明顯高于mfTDLN(P<0.01)。CD123+pDCs主要分布于淋巴結的副皮質區及癌巢，mTDLN和mfTDLN組織中CD123+pDCs陽性細胞數比較差異無統計學意義(P>0.05)。mTDLN組織中 pDC/mDC 比值明顯高于mfTDLN(P<0.01)。見表2和圖2(插頁九)。

2.4 TDLN組織中Foxp3+Treg陽性細胞數與CD123+pDC陽性細胞數和pDC/mDC比值的相關性Foxp3+Tregs與CD123+pDCs陽性細胞數無相關關系(r=0.103,P=0.423)，而Foxp3+Tregs陽性細胞數與pDC/mDC比值呈正相關關系(r=0.421,P<0.01)。

表2 mTDLN和mfTDLN組織中Foxp3+Tregs和CD123+pDCs陽性細胞數及pDCs/DCs比值

3 討 論

近年來，免疫治療逐漸成為腫瘤綜合治療的組成部分。一系列研究[6-9]表明：Tregs與腫瘤免疫逃逸機制有密切關聯，Foxp3+Tregs在多種腫瘤中的比例異常增高，如非小細胞肺癌、上皮性卵巢癌、乳腺癌和惡性胸膜間皮瘤等。FAGHIH等[10]發現：在乳腺癌中新的抗原刺激優先激活T細胞抗原受體(T cell receptor, TCR) Vβ亞家族表達調節的Tregs，從而導致腫瘤免疫耐受。還有研究[11-12]顯示：一些腫瘤細胞會通過腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、腫瘤壞死因子R2(tumor necrosis factor R2, TNFR2)通路間接或者直接誘導Tregs浸潤增多；此外腫瘤細胞分泌趨化因子CCL22能夠與Tregs表面CCR4受體結合，從而導致Tregs在腫瘤組織中的聚集。因此，在以細胞為主的腫瘤免疫過程中，Tregs處于關鍵環節，決定了機體免疫自穩。本研究結果顯示：Foxp3+Tregs在63例CRC標本中均有表達，明顯高于癌旁正常組織；Foxp3+Tregs浸潤與CRC患者淋巴結轉移和TNM分期有密切關聯，Foxp3+Tregs在淋巴結轉移患者腫瘤組織中的浸潤明顯高于無淋巴結轉移患者，隨著TNM分期增高，Foxp3+Tregs在腫瘤組織中的浸潤增多。淋巴結轉移和TNM分期是判斷腫瘤患者預后和存活時間的重要指標。本研究結果證實：Foxp3+Tregs浸潤與CRC患者轉移及預后不良有關。

pDCs是一個獨特而重要的DC亞群，能夠產生大量的干擾素1(interferon-1, IFN-1),具有抗病毒及抗宿主核酸復合物的作用[13-15]。雖然大多數研究均關注pDCs在抗病毒免疫中的作用，但也有部分證據[16]證明：pDCs與腫瘤免疫和促進免疫耐受有關，當受到腫瘤抗原刺激時，pDCs離開骨髓，通過淋巴結中的高內皮小靜脈遷移到T細胞豐富區域和腫瘤組織中的二級淋巴結附近，增強腫瘤細胞的免疫耐受作用。本研究首次證明：CD123+pDCs在正常的結直腸黏膜組織中幾乎不表達，而是散在分布于結直腸癌腫瘤間質，CD123+pDCs與Foxp3+Tregs相互作用的關系以及腫瘤部位的活性調控仍需進一步闡明，因此本研究進一步分析了TDLN組織中Foxp3+Tregs與CD123+pDCs的相關性，未發現明顯相關性，但研究結果顯示：Foxp3+Tregs陽性細胞數與pDC/mDC比值呈正相關關系。內源性Foxp3+Tregs與CD123+pDCs在局部淋巴結中相互作用的分子機制將是本課題組下一步研究的課題。

探討TDLN的免疫狀態是近年來腫瘤免疫研究的熱點問題之一[17]。本研究分析了暴露于免疫耐受因子的mTDLN是否較mfTDLN具有更強的免疫抑制功能：CRC患者mTDLN癌組織中Foxp3+Tregs陽性細胞數較mfTDLN高，CD123+pDCs 陽性細胞數比較差異無統計學意義， 但mTDLN組織中pDC/mDC比值明顯高于mfTDLN。 BATTAGLIA等[18]采用免疫組織化學方法檢測發現：宮頸癌患者mTDLNs 組織中pDC/mDC比值明顯高于mfTDLN 。該結果可能意味著在TDLN中，DCs中2個不平衡的淋巴結亞群與腫瘤的免疫耐受及腫瘤的發生發展有密切關聯。研究[19]顯示：扁桃體鱗狀細胞癌患者中的DC亞群比率是不平衡的，即所謂的DC亞群漂移。然而有關DC亞群漂移的機制目前并不清楚。一些證據[20]表明：腫瘤細胞不僅可以抑制mDCs的遷移和功能，也能吸引淋巴前體細胞 (pre-pDCs)。此外，還有一些研究[21]表明：腫瘤組織中表達的pDCs是不成熟或者功能受損的。上述研究為CRC患者存在DC亞群漂移的理論提供了支持，并提示mTDLN中有腫瘤免疫耐受。

綜上所述，隨著CRC的發展，Foxp3+Tregs在CRC腫瘤組織和TDLN組織中均呈高表達。轉移淋巴結中pDC/mDC比值增加，與Foxp3+Tregs在淋巴結中的分布呈正相關關系，提示DC亞群的比例失調可能是Foxp3+Tregs促進腫瘤發生發展的重要機制之一。然而，Foxp3+Tregs和CD123+pDCs在CRC中的作用機制仍需進一步研究。