溪黃草水提物和醇提物體外抗腫瘤活性研究

孔藝 蔣永和 劉媛

【摘 要】 目的：研究溪黃草（Rabdosia Serra）水提取物和醇提取物對人肝癌細胞（HepG2）、胃癌細胞（MKN-45）和食管癌細胞（TE-1）的增殖抑制作用，分析不同提取方式對腫瘤細胞增殖抑制強弱的差異。方法：采用高效液相色譜法（HPLC）建立溪黃草不同提取物的色譜圖，MTT法檢測溪黃草不同提取物對人肝癌細胞HepG2、人胃癌細胞MKN-45和人食管癌細胞TE-1細胞存活率的影響。結果：溪黃草水提物和醇提物的色譜圖存在差異。溪黃草水提物在人肝癌細胞HepG2、人胃癌細胞MKN-45和人食管癌細胞TE-1的IC50值分別是（2.05±0.19） mg/mL、（1.98±0.16） mg/mL和（1.65±0.18） mg/mL。溪黃草醇提物在上述三種細胞株的IC50值分別是（0.93±0.07 ）mg/mL、（0.68±0.22） mg/mL和（0.63±0.06） mg/mL。溪黃草水提物和醇提物的IC50值存在顯著差異（P<0.01），且溪黃草醇提物的IC50值顯著小于水提物。結論：兩種提取物均具有與濃度相關的細胞體外抑制作用，且醇提物對細胞增殖抑制作用顯著強于水提物。

【關鍵詞】 溪黃草;提取物;抗腫瘤

【中圖分類號】R285.5 ? 【文獻標志碼】 A ? ?【文章編號】1007-8517（2020）12-0008-05

Abstract：Objective To investigate the effect of water and ethanol extracts from Rabdosia serra on the proliferation of human hepatoma HepG2， human gastric carcinoma MKN-45 and human esophageal carcinoma TE-1 cell lines and analyze differences between water and ethanol extracts on inhibition of cancer cells. Method The high performance liquid chromatography （HPLC） was carried out on an Agilent SB-C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm）. The mobile phase was acetonitrile （A）-0.1% acetic acid solution（B） with gradient elution， the detection wavelength was 254 nm， and column temperature was 35℃. After three cancer cell lines were treated with various concentrations of different extracts， cell viability was determined by MTT assay. Results There was difference between HPLC of water extract and ethanol extract from Rabdosia serra. The IC50 values of water extract from Rabdosia serra in human liver cancer cell lines HepG2， human gastric cancer cell lines MKN-45 and human esophageal cancer cell lines TE-1 were（2.05±0.19）mg/mL， （1.98±0.16） mg/mL and （1.65±0.18） mg/mL， respectively. Meanwhile， the IC50 values of ethanol extract from Rabdosia serra in three mentioned above cancer cell lines were （0.93±0.07） mg/mL， （0.68±0.22） mg/mL and （0.63±0.06） mg/mL， respectively. Furthermore， the IC50 value of ethanol extract in cancer cell lines was significantly lower than that of water extract （P<0.01）. Conclusion Two different extracts decreased HepG2， MKN-45 and TE-1 cell viability in a concentration-dependent manner， furthermore， the inhibitory effect of ethanol extract on cell proliferation was stronger than that of water extract.Keywords：Keywords： Rabdosia Serra， Extract， Anti-tumor

溪黃草為2015年版《中華人民共和國藥典》中記載的唇形科植物線紋香茶菜Isodon striatus（Benth.）Kudo或溪黃草Isodon sorra（Maxim.）Kudo的干燥地上部分[1]。溪黃草具有清熱解毒、涼血散瘀、利濕退黃等功效[2]，主要應用于治療濕熱瀉痢，跌打瘀腫，急性黃疸型肝炎，急性膽囊炎等疾病，臨床療效確切[3]。

近年來，關于溪黃草體外抗腫瘤活性研究較多[4-12]。溪黃草水提物以時間依賴的方式抑制肝癌細胞HepG2的體外增殖[4]，溪黃草醇提物在體外可分別抑制結腸癌HCT116細胞增殖、遷移和侵襲[11]，但尚未見關于兩者抗腫瘤活性差異的研究。另一方面，中醫理論認為溪黃草具有保肝利膽的作用，研究也表明溪黃草提取物可抑制肝癌和結腸癌細胞的增殖。目前尚未見關于溪黃草不同提取物對人肝癌HepG2、胃癌 MKN-45和食管癌TE-1細胞株增殖影響的對比研究，其提取物對其他消化道腫瘤是否也具有體外抗腫瘤活性有待研究。本研究采用水和乙醇兩種不同的溶劑對溪黃草進行提取，比較其水提物和醇提物的色譜圖差異，并在體外檢測其對HepG2、MKN-45和TE-1細胞株增殖的影響，旨在為進一步研究溪黃草在肝癌、胃癌和食管癌中具有體外抗腫瘤活性的物質基礎提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 溪黃草（批號171001、171002、171003）由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司溪黃草基地提供，經廣東藥科大學醫藥化工學院田素英高級實驗師鑒定為溪黃草R.serra（Maxim）Hara。人肝癌細胞HepG2和人胃癌細胞MKN-45由廣東藥科大學附屬第一醫院蔡祥勝博士饋贈，人食管癌細胞株TE-1由廣東藥科大學附屬第一醫院劉乃華博士饋贈。甲醇和甲酸（色譜純，Fisher公司）。DMEM培養基、青霉素和鏈霉素、胎牛血清和胰蛋白酶均購自美國Gibco公司。DMSO（細胞用無菌級）和噻唑藍粉末（Methylthiazolyldiphenyl-Terazolium Bromide，MTT）購自sigma公司。

1.2 實驗儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀（包括Waters2695分離單元、2996型二極管陣列檢測器、2420蒸發光散射檢測器、自動進樣器、柱溫箱，美國Waters公司）。sartorius電子天平（廣州靚恒科學儀器有限公司）;N-1000型旋轉蒸發儀（東京理化器械株式會社）;二氧化碳培養箱（美國A-sheville NC公司）;GB-Ⅱ超凈工作臺;Multiscan-GO全波長酶標儀（Thermo公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 溪黃草水提物的制備 稱取溪黃草粗粉100 g，加入10倍量的蒸餾水浸泡1 h，水煎提取1 h，趁熱過濾藥液，再重復提取3次，合并濾液，60 ℃恒溫減壓濃縮至50 mL。將濃縮后的溪黃草提取物放于-80 ℃冰箱中預凍12 h，置于真空冷凍干燥機低溫升華干燥48 h后，密封保存于-20 ℃。使用時，40 mg溪黃草凍干粉加入細胞高糖培養基，超聲至完全溶解并定容為10 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，存于4 ℃備用。

1.3.2 溪黃草乙醇提取物的制備 稱取溪黃草粗粉100 g，加入10倍量60%乙醇浸泡1 h，回流提取1 h，趁熱過濾藥液，再重復提取3次，合并濾液，60 ℃恒溫減壓濃縮至50 mL。將濃縮后的溪黃草提取物放于-80 ℃冰箱中預凍12 h，置于真空冷凍干燥機低溫升華干燥48 h后，密封保存于-20 ℃。使用時，400 g溪黃草凍干粉加入DMSO，超聲至完全溶解并定容為1 mL，存于4 ℃備用。

1.3.3 高效液相色譜條件 Waters C18色譜柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）;流動相：甲醇（A）-0.1%甲酸（B）梯度洗脫（0～38 min，40%A;38～42 min，40%～55%A;42～63 min，55%～60%A）;流速：0.7 mL/min;波長：254 nm;柱溫：35 ℃;進樣量：10 μL。各取溪黃草水提物和醇提物50.0 mg，置10 mL容量瓶，加60%乙醇，超聲30 min，補足60%乙醇至刻度。

1.3.4 細胞培養 人肝癌細胞株HepG2，人胃癌細胞株MKN-45和人食管癌細胞株TE-1細胞用含10 %胎牛血清和1 %青霉素-鏈霉素溶液的DMEM完全培養基培養，置于含5% CO2、溫度為37 ℃的恒溫培養箱，隔天換液。

1.3.5 MTT檢測細胞存活率 取對數期生長狀態良好的HepG2、MKN-45和TE-1細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板內，過夜培養后細胞貼壁且生長狀態良好時開始實驗。實驗分為溪黃草水提物和醇提物兩組，分別向三種細胞株加入不同質量濃度的溪黃草水提物溶液（0.1、0.2、0.5、1、1.5、2、2.5和3 mg/mL）或溪黃草醇提物溶液（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.5和2 mg/mL）進行培養，每個濃度設置6個復孔。同時設置空白調零孔（向未接種細胞的培養孔中加入200 μL/孔 DMEM完全培養基）、陰性對照組（向含有細胞的培養孔中加入200 μL/每孔 DMEM完全培養基）和溶劑對照組（向含有細胞的培養孔中加入200 μL/每孔 含0.05 % DMSO的DMEM完全培養基，僅用于醇提物組）。培養48 h后，棄去原有含藥培養基，每孔加入100 μL 0.5 mg/mL 的MTT溶液，放置于恒溫培養箱中，繼續培養4 h。棄去MTT溶液，每孔加入150 μL DMSO，放置于搖床上，避光震蕩10 min。在多功能酶標儀上測定吸光度（A）值（測定波長為570 nm）。本實驗獨立重復三次，計算細胞增殖抑制率，采用圖表分析軟件GraphPad Prism 5.0計算分析各組IC50值。

細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD570 /對照組OD570）×100%

1.3.6 統計學處理 采用SPSS 19.0進行統計學分析，計量資料用（x±s）表示，使用t檢驗，采用方差分析及后續Dunnett t檢驗對各組與對照組相比或LSD法進行兩兩比較，方差不齊的數據分別用welch，Dunttett T3檢驗方法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 溪黃草水提物和醇提物色譜圖比較 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A 版”，對溪黃草水提取物與醇提取物色譜圖進行比較，結果如圖1所示。醇提物與水提物相比，新增6個峰，分別為圖1中的3號峰（27.0 min）、6號峰（45.6 min）、10號峰（50.3 min）、11號峰（52.6 min）、12號峰（56.3 min）和13號峰（59.6 min）。缺失4個峰，分別為2號峰（20.2 min）、4號峰（28.7 min）、8號峰（46.9 min）和9號峰（48.8 min）。

溪黃草不同提取物色譜圖除色譜峰數目不同外，峰面積也不同（見表1）。這充分說明不同的提取溶劑使溪黃草的化學成分在質和量上發生明顯的變化。

2.2 溪黃草水提物和醇提物均可抑制細胞的增殖 溪黃草水提物和醇提物在HepG2、MKN-45和TE-1細胞株中的IC50值見表2。溪黃草水提物可抑制HepG2、MKN-45和TE-1的細胞增殖，且抑制作用在上述3株細胞之間差異無統計學意義。同樣，溪黃草醇提物對以上3種細胞株的增殖也具有抑制作用，且差異無統計學意義。但重要的是，溪黃草水提物和醇提物對每種細胞株的增殖抑制作用均存在統計學差異，且溪黃草醇提物的IC50值顯著小于水提物，說明溪黃草醇提物對3種不同細胞株的增殖抑制作用顯著強于水提物。

4 討論

溪黃草的化學成分較多，藥效成分復雜。截止到2016年，從溪黃草各基源植物中已分離鑒定了近300種化合物，主要為揮發油類、萜類、多酚類、黃酮類、神經酰胺類化合物及木脂素、甾醇、活性多糖等成分[13-19]。近來，國內學者研究發現溪黃草水煎劑具有抗肝癌活性[4，20]，并證實溪黃草黃酮是溪黃草重要的藥理活性成分之一，存在于溪黃草水溶性總黃酮部位[20]。此外，張慕垚等[11]發現溪黃草乙醇提取物通過下調結腸癌細胞對促癌性小RNA miR-1290的表達和分泌，抑制結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲。林戀竹[12]對比溪黃草葉和莖乙醇提取物的HPLC圖譜，得出全草入藥的科學性，并揭示二萜類化合物是溪黃草乙醇提取物呈現抑菌及抗腫瘤活性的重要物質基礎。本研究采用水和乙醇對溪黃草全草進行提取，發現其水提物和醇提物可分別抑制HepG2、MKN-45和TE-1細胞株的增殖。

本研究中溪黃草水提物抑制肝癌細胞HepG2增殖的IC50值為（2.05±0.19）mg/mL。馮傳平等[20]的研究表明當加入0.5 mg/mL溪黃草水溶性總黃酮作用HepG2細胞株48后h，對細胞增殖抑制率為（34.92±2.31）%，與本研究結果相近。同時水提物也可抑制MKN-45和TE-1細胞株的增殖，且抑制作用在三株細胞之間無統計學差異。本課題組采用醇提物進行研究也得出相同的結論。但值得注意的是，醇提物對HepG2、MKN-45和TE-1細胞株的增殖抑制作用顯著強于水提物。在我國，中藥藥的服用方法多以水煎為主。實驗結果初步證實溪黃草醇提物具有良好的體外抗腫瘤活性，為進一步探尋其在HepG2、MKN-45和TE-1細胞株中具有抑制細胞增殖活性的化合物提供研究方向。

本研究仍有不足之處，如尚未研究溪黃草提取物對細胞凋亡的影響及可能的機制，以及是否具有體內抗腫瘤活性。其次，未檢測溪黃草不同提取物不同批次之間的色譜圖差異。課題組后續將繼續深入研究，并進一步揭示不同的提取方法對溪黃草抗腫瘤物質基礎的提取效率，闡明物質組成差異，尋找溪黃草醇提物中抗腫瘤活性較強的化學成分。參考文獻

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（收稿日期：2020-03-10 編輯：劉 斌）