麥馨允 黃江奇 黃斌 王藝 藍喜丹 廖芬艷



摘 ?要:以‘臺農一號芒果為材料,研究不同劑量短波紫外線和貯藏溫度對采后芒果蒂腐病病原菌(Pestalotiopsis mangiferae)病斑直徑、總酚和類黃酮含量、丙二醛、可溶性蛋白質及過氧化物酶、多酚氧化酶活性的影響。結果表明:4.9 kJ/m2輻照能顯著抑制病斑直徑的擴展,誘導總酚、類黃酮含量的升高,降低可溶性蛋白質的消耗,提高過氧化物酶、多酚氧化酶活性的活力,抑制丙二醛的生成;9.8 kJ/m2輻照會破壞植物細胞損傷,削弱類黃酮、可溶性蛋白質、過氧化物酶、多酚氧化酶上的誘導作用。與25 ℃相比,13 ℃下貯藏可抑制病斑直徑的擴展,維持較高的總酚、類黃酮含量,抑制丙二醛的生成,延遲過氧化物酶、多酚氧化酶活力的達到峰值的時間。4.9 kJ/m2,13 ℃的處理對芒果蒂腐病抑制和品質維持最好。
關鍵詞:芒果;短波紫外線;溫度;蒂腐病;芒果擬盤多毛孢
中圖分類號:S667.7 ? ? ?文獻標識碼:A
Abstract: The effects of different doses of ultraviolet-C (UV-C) and storage temperature on the expansion of lesions caused by Pestalotiopsis mangiferae, total phenols, flavonoids, malondialdehyde, soluble protein, enzyme activities of peroxidase and polyphenol oxidase of postharvest mango fruits were studied. UV-C treatment at 4.9 kJ/m2 significantly suppressed the expansion of lesions, enhanced the content of total phenols and flavonoids, reduced the content of soluble protein, increased the activity of peroxidase and polyphenol oxidase, and inhibited the production of malondialdehyde. UV-C treatment at 9.8 kJ/m2 could damage plant cells, and weaken the promoting effects on flavonoids, soluble proteins, peroxidase and polyphenol oxidase activities. Compared with 25 ℃, low temperature treatment at 13 ℃ could suppress the expansion of lesions, maintain higher content of total phenols and flavonoids, inhibit the formation of malondialdehyde, and delay the peak time of peroxidase and polyphenol oxidase activity. UV-C treatment at 4.9 kJ/m2 combined with storage at 13 ℃ had best a control effect on P. mangiferae of mango fruits, and maintained much better quality of postharvest mango fruits effectively.
Keywords: mango; ultraviolet-C; temperature; stem-end rot disease; Pestalotiopsis mangiferae
DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.04.018
芒果(Mangifera indica L.)屬漆樹科(Sapindaceae)[1],是杧果屬(Dimocarpus)杧果的俗稱。廣西百色右江河谷是全國主要芒果種植基地之一,截止至2015年,該地區芒果種植面積1.8萬hm2,產量12.3萬t,其中‘臺農一號品種種植面積占芒果種植總面積的69.5%[2]。然而芒果在成熟期易引起蒂腐病(stem-end rot disease)[3],發病初期果蒂形成多處褐點,繼續發展會導致果實腐爛,不利于芒果采后貯運與加工[4]。芒果蒂腐病由可可球二孢菌(Botryodiplodia theobromae Pat.)、芒果擬莖點霉(Phomopsis mangiferae Ahmad)、芒果擬盤多毛孢(Pestalotiopsis mangiferae)、小穴殼菌(Dothiorella dominicana Petr. & Cif.)等病原菌引起[5-6]。其中,P. mangiferae分布較廣,在我國廣西、廣東、海南、云南、四川、福建和臺灣芒果種植區的健康芒果中均有存在,2007~2010年間,胡美姣[6]從以上前6產區果園的芒果果實中分離得到P. mangiferae并進行致病性實驗,芒果接種發病率高達89.65%[6-7]。2010~2012年間,楊波[8]從表面無明顯病癥芒果果實中分離得到P. mangi?ferae,其芒果接種發病率77.8%。除蒂部外,P. mangiferae還可潛伏侵染寄主的其他部位,無論是損傷或是健康的芒果葉片、莖均能被侵染[9],還是芒果葉斑病的主要病原菌[10]。羅遠嬋等[11]研究廣西‘四號杧、‘紫花杧芒果病原菌時發現,P. mangiferae在芒果樹開花期之前就潛伏侵染春梢枝條,其會增加芒果果實在發育期間被P. mangiferae潛伏侵染的可能性,從而引起芒果果實成熟期致病。由此可見,P. mangiferae在我國分布廣,發病率高,對采后芒果危害較大,是百色芒果蒂腐病的主要病原菌。而對芒果蒂腐病防治的主流方法是使用苯并咪唑類殺菌劑(BMZs)、甾醇脫甲基抑制劑(DMIs)等[12]進行化學防治。大量使用殺菌劑不但毒性大、殘留高、污染環境,還容易產生抗藥性,海南B. theobromae對多菌靈、甲基硫菌靈就表現出十分嚴重的抗藥性[13],甚至對吡唑醚菌酯殺菌劑也產生抗藥性[14]。
物理防治是通過改善影響病原菌及植物生理變化的環境條件來控制病害的發生和發展,包括低溫貯藏、短波紫外線(ultraviolet-C, UV-C)、氣調貯藏、熱處理等[8]。UV-C輻照工藝簡單節能、無殘留、殺菌強、生態友好,己在蘋果[15]、藍莓[16]、洋蔥[17]、白玉菇[18]等多種果蔬上進行保鮮研究。芒果采后一般冷藏或常溫貯藏,但其屬于冷敏型水果,低于13 ℃易發生冷害[19-21];常溫保藏成本低,一般常溫保藏溫度為25 ℃[22]。至今未見有關UV-C輻照芒果、并在不同貯藏溫度下貯藏對采后芒果蒂腐病病原菌(P. mangiferae)抑菌效果和芒果生理指標影響的研究。本研究以廣西百色產區‘臺農一號芒果為研究對象,探討UV-C輻照(0、4.9、9.8 kJ/m2)和貯藏溫度(13 ℃冷藏、25 ℃常溫)對采后芒果蒂腐菌(P. mangiferae)的抑菌效果和芒果幾種生理指標的影響,為芒果采后UV-C輻照貯藏保鮮提供數據支撐。
1 ?材料與方法
1.1 ?材料
1.1.1 ?材料 ?受試芒果為‘臺農一號,采自廣西田陽縣某果園,挑選生理成熟、無病蟲害、無機械損傷、大小一致、顏色相近、果形良好的芒果。蒂腐菌(P. mangiferae)由百色學院農業與食品工程學院提供,是引起百色地區‘臺農一號芒果蒂腐病的主要病原菌。
1.1.2 ?試劑 ?2,6-二氯酚靛酚,上海藍季生物科技有限公司;硫代巴比妥酸,上海遠慕生物科技有限公司;標準抗壞血酸,國藥集團化學試劑有限公司;福林酚,合肥博美生物科技有限責任公司;沒食子酸,天津市鼎盛鑫化工有限公司;蘆丁,合肥博美生物科技有限責任公司;牛血清蛋白質,上海藍季生物科技有限公司;愈創木酚,天津市光復精細化工研究所;鄰苯二酚,天津市大茂化學試劑廠。
1.1.3 ?儀器與設備 ?紫外燈(20 W);UVC254手持式紫外線強度計,西安欣寶科儀電子科技有限公司;LSY型電熱恒溫水浴鍋,北京醫療設備廠;L6S紫外可見分光光度計,上海儀電分析儀器有限公司;生化培養箱,上海一恒科學儀器有限公司;MDF-U4186S超低溫冰箱,日本三洋電器股份有限公司。
1.2 ?方法
1.2.1 ?試驗設計 ?芒果清洗干凈后吸干表面水分,按照表1隨機分成6組,每組80個果實。輻照和接種方法參考張曉曉等[23]的方法,并有修改:采用20 W紫外燈進行輻照處理,燈管與芒果距離為40 cm,利用UVC254手持式紫外線強度計測定該處的輻照強度為2.3 W/m2,4.9和9.8 kJ/m2的輻照劑量分別需要輻照35.5、71.0 min。各組芒果分別對應表1中的輻照劑量避光輻照,輻照時將果進行翻轉,使整果正反面受到輻照劑量之和為其對應的輻照劑量,然后各組芒果分別對應表1所示貯藏溫度下避光保藏24 h后進行接種染菌。接種前先用75%酒精對果皮進行處理,然后用直徑3 mm滅菌釘在芒果蒂部打2個相距2~3 cm的傷口,待傷口汁液晾干后,接種20 μL 106個/mL病原菌孢子懸濁液,晾干,然后將芒果裝入保鮮袋中,各組芒果分別對應表1所示溫度下貯藏。每隔一定天數取6個芒果病斑周圍健康果肉組織(直徑1.5 cm、厚度2.0 cm)用于生理指標測定。
1.2.2 ?測定項目與方法 ? 病斑直徑測定采用游標卡尺測量病斑直徑,以所取芒果數量的測量平均值作為病斑直徑。總酚含量測定采用Folin- Ciocalteu法測定總酚含量[24-25]。類黃酮含量測定以蘆丁為對照品測定樣品中類黃酮的含量[24-26]。丙二醛(malondialdehyde, MDA)測定采用硫代巴比妥酸吸光光度法測定[27]。芒果可溶性蛋白質(soluble protein, SP)含量的測定采用紫外吸收法測定[27]。過氧化物酶(peroxidase, POD)活力的測定采用吸光光度法[27]。多酚氧化酶(poly?phenol?oxidase, PPO)活力的測定采用吸光光度法[27]。
1.3 ?數據處理
采用PASW Statistics 18軟件進行方差分析,差異顯著性分析采用LSD法。
2 ?結果與分析
2.1 ?輻照劑量和貯藏溫度對芒果蒂腐病的影響
從圖1A、圖1B可以看出,病斑直徑隨著貯藏時間的延長而增大;貯藏溫度升高,病斑直徑也隨之增大。由圖1A可知,13 ℃下,對照組在第16天后病斑直徑就顯著增大(P≤0.01),在第35天時,病斑直徑增大到4.16 cm,而4.9、9.8 kJ/m2組在第35天時病斑直徑分別為2.97、3.94 cm,比對照組病斑直徑下降了28.61%、5.29%。由圖1B可知,25 ℃下,對照組的芒果在第11天時病斑直徑顯著增大(P≤0.01),在第21天時,病斑直徑增大到4.93 cm;而4.9 kJ/m2組在第13天時病斑才顯著增大(P≤0.01),在第21天時,病斑直徑增大到4.77 cm,比對照組病斑直徑下降了3.25%;9.8 kJ/m2組在第9天左右時病斑直徑也在增大,但增速較小,在第21天時病斑直徑為4.94 cm,和對照組病斑直徑差異不大。
2.2 ?輻照劑量和貯藏溫度對芒果總酚含量的影響
從圖2A、圖2B可以看出,芒果貯藏過程中總酚含量變化趨勢為先增大后減小。由圖2A可知,13 ℃下,0~4 d時,對照組與輻照組的總酚含量差異不大;第6天時,對照組總酚含量明顯下降且低于輻照組,輻照組在第12天時總酚含量開始才下降。輻照可以延緩總酚含量達峰時間,并誘導芒果生成更多酚類物質。25 ℃下總酚變化規律和13 ℃下的類似,經輻照后的芒果的總酚含量均稍高于對照組,UV-C輻照后誘導合成更多的酚類物質,這與Pataro等[28]的研究結果類似。相同輻照劑量、不同溫度而言,13 ℃和25 ℃對照組的總酚含量從第16天開始,變化差異較大,第18天,25 ℃對照組的總酚含量就下降到110.48 mg/ 100g,比13 ℃對照組的總酚含量下降了18.26%。類似的,13 ℃和25 ℃下4.9 kJ/m2組的總酚含量也是在第16天開始變化差異較大,第18天時,25 ℃的總酚含量比13 ℃的總酚含量下降了16.16%。13 ℃和25 ℃下9.8 kJ/m2組的總酚含量在第14天開始變化差異較大,第18天時,25 ℃的總酚含量比13 ℃的總酚含量下降了21.10%。
2.3 ?輻照劑量和貯藏溫度對芒果類黃酮含量的影響
從圖3A、圖3B可以看出,芒果在貯藏過程中,類黃酮含量先增大后減少。無論是13 ℃還是25 ℃下貯藏,經UV-C輻照后的芒果果肉類黃酮含量普遍高于對照組,但9.8 kJ/m2組比4.9 kJ/m2組的類黃酮含量下降得更快。第33天時,13 ℃下9.8 kJ/m2組類黃酮含量比同一溫度下4.9 kJ/m2組的類黃酮含量下降了12.21%。同樣的,在第22天,25 ℃下9.8 kJ/m2組類黃酮含量比同一溫度下4.9 kJ/m2組的類黃酮含量下降了24.36%。相同輻照劑量、不同溫度而言,25 ℃對照組在0~16 d前,其類黃酮含量普遍比13 ℃的黃酮含量多,而18 d后,其類黃酮含量比13 ℃的類黃酮含量要少;25 ℃ 4.9 kJ/m2組在0~18 d前,其類黃酮含量普遍比13 ℃的類黃酮含量多,而18 d后,其類黃酮含量比13 ℃的類黃酮含量要少;25 ℃ 9.8 kJ/m2組在0~16 d前,其類黃酮含量普遍比13 ℃的類黃酮含量多,而22 d時,其黃酮含量比13 ℃的類黃酮含量要少。
2.4 ?輻照劑量和貯藏溫度對芒果MDA含量的影響
從圖4A、圖4B可以看出,MDA含量隨著貯藏時間的延長而增加。同一貯藏溫度下,對照組芒果MDA含量整體平均水平比輻照組芒果MDA含量高,對芒果進行適當的輻照處理,可減少MDA的積累。對同一輻照劑量的低溫組和常溫組相比較,無論是對照組還是輻照組,在相同的貯藏時間內,25 ℃的MDA含量均比13 ℃的含量高。第22天時,25 ℃下對照組、4.9 kJ/m2組、9.8 kJ/m2組的MDA含量分別為0.69、0.56、0.59 μmol/g,而13 ℃下對照組、4.9 kJ/m2組、9.8 kJ/m2組的MDA含量到第24天時分別為0.58、0.52、0.57 μmol/g,不同溫度下的相同劑量組相比較,13 ℃下的處理其MDA含量普遍比25 ℃下的處理低。
2.5 ?輻照劑量和貯藏溫度對芒果SP含量的影響
從圖5A、圖5B可以看出,SP含量隨貯藏時間的延長而呈下降趨勢。由圖5A可知,13 ℃下,貯藏的第1~5天,對照組和9.8 kJ/m2組的SP含量急劇下降。整個貯藏期間,4.9 kJ/m2組SP含量均高于其他2組。貯藏第34天時,其SP含量是對照組和9.8 kJ/m2組的1.56、2.07倍。由圖5B可知,25 ℃下各處理SP含量的變化和13 ℃的相似,在貯藏第17天時,4.9 kJ/m2組的SP含量是對照組和9.8 kJ/m2組的2.03、1.92倍。此外,對同一輻照劑量的低溫組和常溫組相比較,無論是對照組還是輻照組,25 ℃的SP含量都比13 ℃的高。
2.6 ?輻照劑量和貯藏溫度對芒果POD活力的影響
從圖6A、圖6B可以看出,POD活性先上升后下降。由圖6A可知,13 ℃下,前5 d,對照組與2個輻照組的POD活性差異不大。貯藏第5天開始,對照組、4.9 kJ/m2組、9.8 kJ/m2組POD活力增大較快,到28 d時達到峰值,其峰值分別為:1.40、1.91、1.21 ΔOD470/(min·g);整個貯藏期間,4.9 kJ/m2組POD活性均高于其他2組。由圖6B可知,25 ℃下,4.9 kJ/m2組的POD活性普遍較高于其他2組,其峰值也分別比對照組和9.8 kJ/m2組要大46.81%、42.20%。由此可見,經適量輻照處理的芒果POD活性比未輻照處理的要高。此外,對同一輻照劑量的低溫組和常溫組相比較,無論是對照組還是輻照組,13 ℃的POD活性無論是平均活性還是最大活性,均比25 ℃的POD活性要高。
2.7 ?輻照劑量和貯藏溫度對芒果PPO活力的影響
從圖7A、圖7B可以看出,總體而言,PPO活性先上升后下降。由圖7A可知,13 ℃下,無論是對照組還是輻照組,PPO活性在0~31 d前,上升的趨勢較為緩慢,31 d后,PPO活性皆迅速上升。第34天時,對照組、4.9 kJ/m2組、9.8 kJ/m2組PPO活性分別比第31天時的PPO活性提高了3.81、1.96、4.00倍;整個貯藏期間,4.9 kJ/m2組PPO活性均高于其他2組,由于只監測到0~34 d的PPO活性的數據,未能確定PPO的達峰時間和峰值數據。由圖7B可知,25 ℃下,在0~5 d內,對照組、9.8 kJ/m2組的PPO活性隨貯藏時間的增加而增加,且達到峰值;4.9 kJ/m2組在0~9 d內隨時間的增加,其PPO活性也隨之迅速增大,在第9天時達到最大值,最大值為1.47 ΔOD420/(min·g),其PPO活性最大值分別是對照組、9.8 kJ/m2組PPO活性最大值的1.94、2.73倍;和13 ℃相同的是,整個貯藏期間,4.9 kJ/m2組PPO活性均高于其他2組。
3 ?討論
UV-C具有殺菌消毒能力,較多應用在食品工業用水的消毒[29]。除殺菌外,紫外線輻照對植物組織產生興奮作用,激活植物細胞防御反應,促進
植物合成次生代謝產物,進而提高植物防御能力及抗氧化活性,有效延緩果蔬成熟衰老進程[30-32]。無論是13 ℃還是25 ℃下,輻照組病斑直徑都小于對照組,說明UV-C輻照能有效抑制病斑的擴展,有兩方面的原因:一是UV-C可穿透微生物細胞膜,破壞核酸,引發突變,使細胞遺傳物質的活性喪失,導致微生物失去繁殖能力或死亡[33];二是UV-C輻照提高芒果的抗病性,增強抗氧化酶活性,從而抑制病原菌的感染。關于溫度對病斑擴展的影響,Tandon等[9]對P. mangiferae的病理進行了研究,發現將芒果放置在8 ℃下沒有被病菌感染的跡象,而在24~30 ℃,芒果腐爛較為嚴重。胡美姣等[34]研究P. mangiferae生物學特性得到菌絲生長最適溫度為25~28 ℃,孢子萌發最適溫度為32 ℃。本研究中,在相同劑量輻照下,低溫組能減緩病斑直徑擴展速度,說明13 ℃下P. mangiferae的繁殖受到抑制,從而降低病害指數。此外,低溫貯藏除了能抑制P. mangiferae的繁殖,還能抑制果蔬呼吸作用,延緩芒果衰老的進程,而高溫貯藏則會增強果蔬呼吸代謝,加速細胞分解,嚴重降低果蔬耐貯性與抗病性[35]。UV-C和低溫貯藏都能抑制病斑擴展,但低溫貯藏的抑制效果更佳,這可能是因為UV-C穿透有一定限制,只能殺滅表層的P. mangiferae。和25 ℃相比,13 ℃下不同輻照劑量的芒果其病斑直徑差異較大,說明低溫和UV-C有協同作用,兩者聯合使用,對P. mangiferae的抑制效果更佳。
芒果采后抵御病害能力體現在抗氧化活性上。酚類是植物次級代謝產物,具有較強的抗氧化、抑菌能力、抑制細菌群感效應[36]。Perumal等[37]研究表明,百里香精油(主要成分為百里酚、鄰氨基酚和萜烯)對芒果Lasiodiplodia theobr?omae有明顯的抑制作用。本研究中輻照組能刺激芒果體內合成更多酚類,有效維持芒果總酚含量,而多酚類物質結構具有抗氧化能力,可以清除自由基和螯合氧化還原活性金屬[38],增強芒果抗病性能力。對相同輻照劑量、不同溫度而言,在0~ 16 d前,不同溫度對芒果平均總酚含量影響較小;然而對于相同輻照劑量下的總酚峰值而言,25 ℃下對照組的比13 ℃的稍小,25 ℃下輻照組的比13 ℃的稍大,由此可見,低溫可能會輕微抑制UV-C誘導總酚的合成。這一發現在Cantos等[39]、Wang等[40]的研究中也有報道;在第16天后,不同溫度對芒果總酚的影響才逐漸變大,低溫有助于芒果在貯藏期間維持較高的總酚含量,這可能是由于低溫可顯著抑制芒果的呼吸作用,同時芒果細胞組織內的化學反應和酶促反應也得到抑制,將代謝消耗的營養物質降至最低,因此可讓總酚含量維持在較高水平。和酚類物質類似,輻照同時也誘導了苯丙烷代謝的增強,使機體合成更多的類黃酮物質,但9.8 kJ/m2的輻照劑量反而讓黃酮類物質減少,這可能是由于更多苯丙烷的代謝方向轉成了木質素的合成。相同輻照劑量、不同溫度下0~16 d時,25 ℃類黃酮含量較高,這可能是因為真菌侵染也是刺激植物產生次級代謝產物的方式之一[41],13 ℃能抑制真菌繁殖,真菌侵染芒果的病況不嚴重,在0~16 d前產生的類黃酮含量較少。在16 d后,13 ℃的類黃酮含量比25 ℃的要多,這可能是低溫抑制果蔬的呼吸作用、降低新陳代謝所致。
對于相關防御酶而言,POD、PPO是果蔬體內普遍存在的氧化還原酶,受到外界刺激、病原菌侵染時會做出應答反應[27]。Jin等[42]研究發現,UV-C處理草莓,可增強草莓POD、PPO的酶活,有效防治灰霉病。本研究中發現,適量輻照的POD、PPO活性比對照組要高,說明UV-C可增強抗氧化酶活性,誘導提高其自身抗病性,病發程度較輕。而輻照劑量過大(9.8 kJ/m2組)不利于采后芒果的保鮮。溫度對酶活的影響而言,13 ℃的POD、PPO活性由于低溫而分別在0~ 25 d、0~31 d時受到抑制,而25 ℃下的POD、PPO活性則伴隨著呼吸躍變,在0~10 d內達到峰值,然后下降。
MDA具有細胞毒性,表征芒果的衰老程度。UV-C處理的MDA含量較低,說明芒果組織細胞氧化損傷較對照組的輕微,UV-C抑制芒果細胞膜氧化損傷[43]。在不同溫度、相同劑量下,低溫抑制脂質氧化反應,減少MDA的生成,延緩衰老。
SP是構成果蔬中酶、細胞的重要組成部分,與果蔬生長發育、成熟衰老,抗病性密切相關[27]。13 ℃下的第1~5天,對照組和9.8 kJ/m2組的SP含量急劇下降,這可能是由于芒果采收后營養供應突然被切斷,生理代謝旺盛,自身SP被消耗[44]。而4.9 kJ/m2組SP含量最高,說明適量UV-C輻照果蔬能有效抑制SP含量的下降,低劑量、多次輻照能明顯抑制SP的減少,這在菠菜、韭菜輻照研究中得到證實[45]。溫度對SP的影響而言,25 ℃下的SP含量比13 ℃的要高,一方面和類黃酮類似,高溫下真菌侵染進程持續加速,刺激芒果產生應激反應,誘導SP的合成。另一方面可能是由于25 ℃下的芒果成熟衰老進程較快,在衰老過程中,膜的完整性和功能性的喪失可能會導致瞄定膜蛋白質的增溶[46]。
綜上所述,適宜劑量的UV-C輻照對芒果采后蒂腐病具有一定防治作用。UV-C輻照能顯著抑制P. mangiferae病斑直徑的擴展、誘導增強總酚含量、減少丙二醛含量;但過量的UV-C輻照反而起到反作用,9.8 kJ/m2組在類黃酮和可溶性蛋白質含量、POD和PPO活力上的數值不但沒有起到誘導抗病作用,反而與對照組間的差異不明顯。這可能是由于高劑量UV-C輻照后導致細胞損傷,從而導致部分有益生理活動受到影響。與25 ℃相比,13 ℃下貯藏可明顯抑制病斑直徑的擴展速度,維持較高的總酚、類黃酮含量,抑制丙二醛的生成,延遲POD、PPO酶活力的達到峰值的時間。芒果屬于呼吸躍變型水果,延遲POD、PPO酶活力的達峰時間,意味著延緩果實的衰老進程。
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