響應面法優化海南可可豆中原花青素的提取工藝

房一明 初眾 谷風林 賀書珍 賴劍雄

摘 ?要：本研究采用響應面分析法確定海南可可豆中原花青素提取的最佳工藝條件，對提取得率的影響因素進行單因素分析后，探討料液比、乙醇濃度、提取時間和溫度間的顯著性影響和交互作用。結果表明：可可原花青素的最優提取工藝條件為乙醇濃度67%、料液比1∶20（g/mL）、提取時間88 min、提取溫度76 ℃。此工藝條件下，可可原花青素提取得率為6.21%。此結果為海南可可豆的開發利用提供基礎理論依據。

關鍵詞：可可;原花青素;提取得率;響應面分析法

中圖分類號：S571.3 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： The extraction of procyanidin from the cocoa beans of Hainan was investigated by the response surface methodology. Single experiments were used to explore the effects of material-to-liquid ratio， extraction concentration， extraction times and extraction temperature on the yield of procyanidin. Based on the analysis of significance and interaction among different factors， the optimal condition of extraction technology was obtained as followed： solvent concentration 67%， material-to-liquid ratio 1∶20 （g/mL）， time 88 min and temperature 76 ℃. The extraction rate of procyanidin of the optimized procedure reached 6.21%. The results provide a theoretical basis for the exploitation and utilization of cocoa beans in hainan.

Keywords： cocoa beans; procyanidin; extraction rate; response surface methodology

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.04.020

可可為熱帶地區重要的經濟作物，因其獨特的風味和營養價值，被廣泛應用于巧克力、固體飲料、休閑食品、醫藥品、化妝品等領域[1]。近年來，國內外對可可的相關研究主要集中在可可豆中的多酚類物質。研究結果表明，可可豆是一種富含多酚類物質的食品來源，其具有極強的抗氧化活性，能有效地清除羥自由基（?OH）和超氧陰離子自由基（O2??），有效地抑制脂質氧化[2]。

可可豆中富含多酚類物質，其可以進一步分類為類黃酮，并且這些類黃酮中含有豐富的原花青素[3]。在可可豆中最常見的類黃酮是黃烷-3-醇、兒茶素、表兒茶素和原花青素，其中原花青素含量較高。黃酮類化合物是可可豆中重要的組成成分，其能夠提供潛在的心血管健康益處，有助于平衡體內膽固醇，具有抗氧化作用[4]。雖然已知可可豆中含有多酚類化合物，但總含量因原產國、加工方式等不同而異。原花青素或縮合單寧主要由兒茶素的二聚物，低聚物和聚合物組合而成[5]，這些原花青素使可可豆的風味呈現苦味[6]。谷風林等[7]研究了海南可可豆的多酚含量，對不同發酵方式下的可可多酚類化合物進行了定量分析;Nazaruddin等[8]研究發現，在可可豆發酵過程中，由于進一步的氧化作用，多酚化合物縮合，豆中的原花青素濃度降低;Gultekin等[9]研究表明，焙烤中溫度的升高顯著降低了包括原花青素的多酚水平。目前，關于可可發酵豆的原花青素優化提取工藝的研究未見報道。

響應面分析法（response surface methodology， RSM）是合理利用試驗設計，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數關系，通過分析回歸方程從而尋求最佳工藝參數，解決多變量問題的一種統計學方法。能夠以較少的試驗數量和時間對實驗進行全面研究，同時可評價各因素間的交互作用[10-11]。

為研究不同提取條件對可可豆中的原花青素提取得率的影響，本研究以海南可可豆作為研究對象，采用響應面分析法，以提取溶劑濃度、料液比、提取時間、提取溫度作為影響因素，以海南可可豆中的原花青素提取得率為考察指標，對可可豆中原花青素的提取工藝進行優化，為海南可可豆的開發利用提供基礎理論依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?試驗材料 ?可可鮮果（品種為‘熱引4號）采摘于中國熱帶農業科學院香料飲料研究所內，采摘時生長期為5個月，果皮為黃色、淡紅色的成熟鮮果。原花青素標準品（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司），香草醛（上海國藥控股有限公司），甲醇（美國Fisher公司），乙醇、鹽酸均為分析純。

1.1.2 ?儀器與設備 ?FD-2A冷凍干燥機，北京博醫康;Master-S plus UVF實驗室專用超純水機，中國和泰;AL104電子天平，美國Mettler-Toledo;SHZ-C水浴恒溫振蕩器，上海博迅;Specord 250 Plus紫外可見分光光度計，德國耶拿;DLSB- 5L/10低溫冷卻液循環泵，鞏義予華;MB45快速水分測定儀，美國奧豪斯;R-215旋轉蒸發儀，瑞士步琪。

1.2 ?方法

1.2.1 ?實驗材料的制備 ?收獲新鮮成熟可可果，將其中的可可鮮豆取出并放入木箱中發酵，箱底部留有排液孔，發酵時可可鮮豆外層果肉中的膠體粘液物質化成發酵液伴隨發酵進程排出，周圍保持通風，發酵時木箱上部用亞麻布覆蓋[12]。發酵木箱（0.8 m×0.8 m×0.8 m）由中國熱帶農業科學院香料飲料研究所提供，可可果為同一季節收獲并成熟。發酵時間為7 d，期間定時用木鏟攪拌可可豆，并進行倒箱，發酵完成后的豆子經清洗、日曬干燥、真空冷凍干燥、去皮、精磨、脫脂待用。

1.2.2 ?原花青素標準曲線的繪制 ?采用香草醛-鹽酸法，在Ma等[13]的研究方法基礎上，略作修改。準確稱取原花青素標準品20 mg放于50 mL容量瓶并用色譜甲醇充分溶解定容。準確吸取原花青素標準溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，放于10 mL容量瓶中并用甲醇定容。分別取1 mL于10 mL具塞試管中，依次加入3 mL香草醛甲醇溶液（4%）和1.5 mL濃鹽酸，用甲醇稀釋至刻度并混合均勻，室溫條件下，避光反應20 min;將去離子水替代樣品反應體系作為參比，于500 nm處測定吸光度。擬合不同濃度的吸光度值，得到標準曲線，以吸光度值對質量濃度進行回歸分析，得到標準曲線方程為y=8.8703x+ 0.0345，R2=0.9927。

1.2.3 ?可可豆中原花青素的測定 ?參照Ma等[13]研究的提取方法并略作修改，準確稱取脫脂的可可粉置于50 mL具塞錐形瓶中，加入提取溶劑乙醇后放入水浴恒溫振蕩器中加熱提取，提取液通過0.45 ?m微孔濾膜真空抽濾，除去固形物，得到待測溶液。準確量取1 mL待測溶液，用提取溶劑稀釋10倍，參照標準溶液的測定方法，在波長500 nm處，測定樣品溶液的吸光度值，代入標準曲線方程，計算得到各樣品的原花青素含量。

原花青素含量= [C×V ×n/W]×100%

式中：C為原花青素濃度（mg/mL）;V為提取液的體積（mL）;n為稀釋倍數;W為樣品的質量（mg）。

1.2.4 ?單因素試驗 ?以乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度為因素條件進行單因素試驗，分別考察各因素對可可中原花青素提取得率的影響（表1）。

1.2.5 ?響應面試驗 ?根據Box-Behnken設計原理，在單因素試驗的基礎上，運用Design-Expert 8.0.6軟件，以可可原花青素提取得率為響應值，設置乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時間（C）和提取溫度（D）的4因素3水平的試驗條件。試驗的因子及水平如表2。

1.3 ?數據處理

采用Origin Pro 9.1軟件進行誤差分析并繪制圖形，用以評估不同提取條件對可可豆中原花青素提取得率的影響，使用Design-Expert 8.0.5設計軟件進行響應面分析，優化海南可可豆中原花青素的提取工藝。

2 ?結果與分析

2.1 ?單因素試驗分析

2.1.1 ?乙醇濃度對可可豆中原花青素提取得率的影響 ?當料液比1∶20，提取溫度為75 ℃，提取時間為1.5 h時，采用50%、60%、70%、80%、90%體積分數的乙醇溶液提取可可原花青素，以乙醇濃度為橫坐標，原花青素提取得率為縱坐標作圖，見圖1。

由圖1可知，乙醇濃度對可可中原花青素提取得率有一定影響。可可原花青素得率隨乙醇濃度的增加逐漸增大，乙醇濃度為70%時，可可中原花青素得率為最大值，當溶劑溶度逐漸增大時提取得率開始降低。這是由于乙醇濃度不同導致浸提溶劑極性大小不同，因此對可可原花青素的溶出效果有一定影響。同時，原花青素是一種多酚類物質，含較多羥基且具有一定極性。依據相似相溶的原理，當溶劑極性和原花青素極性相當時，溶解度達到最大。同時，得率最多，隨著乙醇濃度進一步增加。其中，一部分醇溶性成分溶出，同原花青素競爭與乙醇的結合，會導致原花青素提取得率下降[14]。因此，海南可可豆中原花青素提取的最佳乙醇濃度為70%。

2.1.2 ?料液比對可可豆中原花青素提取得率的影響 ?當乙醇濃度為70%，提取溫度為75 ℃，提取時間為1.5 h時，設置料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），以料液比為橫坐標，原花青素提取得率為縱坐標作圖，如圖2。

由圖2可知，隨著料液比增大，原花青素的提取得率也逐漸增大，當料液比達到1∶20 （g/mL）時，原花青素得率達到最大值，當料液比增加至1∶25（g/mL）時，原花青素得率開始下降。這是由于隨提取溶劑體積的增加，可可粉與溶劑的接觸面積增大，從而有利于促進原花青素成分的溶出，當料液比增加到一定程度時，會增大雜質的溶出量，降低原花青素的純度，且過高的料液比會造成溶劑的浪費，增加原料成本[10]。因此，1∶20（g/mL）為可可豆中原花青素提取的最佳料液比條件。

2.1.3 ?提取時間對可可豆中原花青素提取得率的影響 ?在乙醇濃度為70%，料液比為1∶20（g/mL），提取溫度為75 ℃條件下，設置提取時間分別為0.5、1、1.5、2、2.5 h，設定提取時間為橫坐標，原花青素提取得率為縱坐標作圖，如圖3。

由圖3可知，隨著提取時間的延長，原花青素提取得率先增大后減少，當提取1.5 h時，原花青素提取得率為最大值，當提取時間進一步增加，提取得率開始降低，這是由于延長提取時間會增加原花青素提取得率，但原花青素為熱不穩定多酚類物質，提取時間過長會破壞原花青素的結構，使原花青素熱分解[15]。因此，最佳的提取時間為1.5 h。

本研究中，比較了不同萃取條件下可可多酚原花青素的提取效果，通過單因素和響應曲面優化試驗，結果表明，海南可可豆中原花青素的最佳提取工藝為浸提溶劑濃度67%、料液比1∶20（g/mL）、提取時間88 min、提取溫度76 ℃。此條件下的原花青素提取得率為6.21%，高于Gu等[23]研究中4.1%的提取得率。模型分析可描述由響應面確定的原花青素提取得率，通過兩兩因素交互作用研究顯示，溶劑濃度對原花青素提取得率的影響更為顯著。提取溫度和溶劑濃度對原花青素提取得率的影響相差不大。與料液比相比，提取時間和溫度條件對海南可可豆中原花青素提取得率的影響較為顯著。該研究的目的是確定可可豆中原花青素的最優萃取條件，經過優化的萃取工藝證明含有更多的原花青素，為海南可可豆中的原花青素的有效開發利用提供一定的借鑒基礎。

參考文獻

[1] 房一明， 谷風林， 初 ?眾， 等. 發酵方式對海南可可豆特性和風味的影響分析[J]. 熱帶農業科學， 2012， 32（2）： 71-75.

[2] 易橋賓， 谷風林， 那治國， 等. 發酵和焙烤對可可豆多酚、黃酮和風味品質的影響[J]. 食品科學， 2015， 36（15）： 62-69.

[3] Othman A， Ismail A， Abdul Ghani N， et al. Antioxidant capacity and phenolic content of cocoa beans[J]. Food Chemistry， 2007， 100（4）： 1523-1530.

[4] Steinberg F M， Bearden M M， Keen C L. Cocoa and chocolate flavonoids： Implications for cardiovascular health[J]. Journal of the American Dietetic Association， 2003， 103（2）： 215-223.

[5] Guyot S， Marnet N， Laraba D， et al. Reversed-phase HPLC following thiolysis for quantitative estimation and characterization of the four main classes of phenolic compounds in different tissue zones of a French cider apple variety （Malus domestica var. Kermerrien）[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1998，46（5）： 1698-1705.

[6] Santos-Buelga C， Scalbert A. Proanthocyanidins and tannin-like compounds-nature， occurrence， dietary intake and effects on nutrition and health[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2000， 80（7）： 1094-1117.

[7] 谷風林， 房一明， 徐 ?飛， 等. 發酵方式與萃取條件對海南可可豆多酚含量的影響[J]. 中國食品學報， 2013， 13（8）： 268-273.

[8] Nazaruddin R， Seng L K， Hassan O， et al. Effect of pulp preconditioning on the content of polyphenols in cocoa beans （Theobroma Cacao） during fermentation[J]. Industrial Crops and Products， 2006， 24（1）： 87-94.

[9] Gultekin Ozguven M， Berktas I， Ozcelik B. Change in stability of procyanidins， antioxidant capacity and in-vitro bioac-cessibility during processing of cocoa powder from cocoa beans[J]. LWT-Food Science and Technology， 2016， 72： 559-565.

[10] 陳 ?健， 孫愛東， 高雪娟， 等. 響應面分析法優化超聲波提取檳榔原花青素工藝[J]. 食品科學， 2011， 32（4）： 82-86.

[11] 彭芳剛， 李綺麗， 吳衛國. 響應面法優化紅蓮外皮原花青素的提取工藝研究[J]. 現代食品科技， 2013， 29（6）： 1349-1354， 1315.

[12] Minifie B W. Chocolate， cocoa and confectionery： science and technology[M]. Netherlands： Springer， 1989.

[13] Ma X， Zhou X Y， Qiang Q Q， et al. Ultrasound-assisted extraction and preliminary purification of proanthocyanidins and chlorogenic acid from almond （Prunus dulcis） skin[J]. Journal of Separation Science， 2014， 37（14）： 1834-1841.

[14] 樊梓鸞， 林秀芳， 王 ?麗， 等. 響應面法優化高剪切分散乳化提取懸鉤子多酚[J]. 食品與生物技術學報， 2014， 33（4）： 355-360.

[15] 溫志英， 曹 ?妍. 響應面法優化花生紅衣原花青素微波輔助提取工藝[J]. 中國糧油學報， 2011， 26（6）： 97-101.

[16] 黃 ?曼， 徐麗嫚， 陳 ?靜， 等. 響應面法優化高粱外種皮中原花青素的超聲波輔助提取工藝[J]. 食品科學， 2012， 33（24）： 26-30.

[17] 王長春， 林向陽， 葉南慧， 等. Plackett Burman設計和響應面分析法優化枇杷葉中總黃酮的超聲波提取工藝[J]. 中國食品學報， 2013， 13（3）： 84-91.

[18] 黃尚榮， 楊雪娜， 張 ?露， 等. 龍眼皮原花青素提取工藝優化及其抗氧化活性測定[J]. 食品科學， 2014， 35（10）： 68-75.

[19] 王海燕， 李 ?睿， 曾 ?秀， 等. 響應面優化超聲波提取桑葉槲皮素工藝[J]. 食品科學， 2014， 35（22）： 56-62.

[20] Gunst R F. Response Surface methodology： process and product optimization using designed experiments[J]. Technometrics， 1996， 38（3）： 284-286.

[21] Kuo C H， Chen B Y， Liu Y C， et al. Optimized ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds from polygonum cuspidatum[J]. Molecules， 2013， 19（1）： 67-77.

[22] 焦天慧， 蘆 ?宇， 葉琳琳， 等. 超聲波輔助提取紅樹莓籽中原花青素及其抗紫外活性評價[J]. 中國食品學報， 2019， 19（6）： 98-105.

[23] Gu L W， House S E， Wu X L， et al. Procyanidin and catechin contents and antioxidant capacity of cocoa and chocolate products[J]. Agricultural and Food Chemistry， 2006， 54 （11）： 4057-4061.