魏飛力,吳夢麗,郭 麗,謝棒祥,杜宇瓊,陳德喜,劉曉霓
(1. 首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院 北京市肝病研究所 北京市肝炎與肝癌精準醫(yī)療及轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心 北京 100069;2. 首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院 北京 100069)
肝癌是我國常見的惡性腫瘤,近年來,發(fā)病率逐年上升,死亡率也位居前列[1]。多數(shù)肝癌患者在發(fā)現(xiàn)時已處于晚期,由于缺乏有效的治療措施,因此,晚期肝細胞癌在臨床治療中仍是一個亟待解決的難題[2]。在我國草藥被廣泛用于腫瘤防治,特別是在晚期肝細胞癌治療中,發(fā)揮著重要的作用。瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)為瑞香科狼毒屬植物狼毒的干燥根,其治療腫瘤在我國古代醫(yī)學典籍中早有記載,近年來發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒中的許多成分在體內(nèi)外均具有抗腫瘤作用[3-9],是一種潛在的抗腫瘤藥物,但其具體的抗腫瘤活性成分及作用機制目前尚不清楚。瑞香狼毒自身也具有明顯的毒性,有研究發(fā)現(xiàn),隨著炮制方法的改變,瑞香狼毒中化學成分的含量及有效成分均發(fā)生著相應的變化,導致其毒性程度也作出相應改變,因此在臨床中使用十分謹慎[10-14]。如果能探明瑞香狼毒的活性成分,明確其治療晚期肝細胞癌的作用機制,對于瑞香狼毒增效減毒,開發(fā)利用以及晚期肝細胞癌的治療都具有重要的意義。本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法,通過篩選瑞香狼毒的活性成分,利用IPA 軟件,預測其治療晚期肝細胞癌的分子及信號通路,為探索其多靶點治療晚期肝細胞癌的機制提供參考。
通過檢索TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/),在“Herb name”詞條框中輸入“瑞香狼毒”,點擊search,獲取單味中藥化合物條目,點擊進入并獲取中藥分子信息,包括活性成分的分子名(molecule name)、相對分子質(zhì)量(MW)、類藥性(DL)、口服生物利用度(OB,%)、小腸上皮細胞滲透率(Caco-2)[15]。本研究中瑞香狼毒選用以化合物的口服生物利用度(OB)≥10%,化合物的類藥性(DL)≥0.18作為篩選條件。
根據(jù)1.1項下篩選出符合條件的活性成分,在TCMSP 平臺中,點擊“Related Targets”,獲取成分的“Targets Infomation”,從獲取的信息中得到該成分作用的靶蛋白名(targetname=protein names),在Uniprot(universal protein knowledgebase)(www.Uniprot.org)中,使用Uniprot KB 檢索功能,在檢索框中輸入靶蛋白名(target name),檢索條件為“organism:homo sapiens 和reviewed: yes”,獲取基因名(gene name),該部分數(shù)據(jù)中包括中藥活性成分中對應人類的相關(guān)靶蛋白。
將檢索到的瑞香狼毒活性成分對應的靶蛋白在線提交至Ingenuity Pathway Analysis(IPAhttp://www.ingenuity.com/)生物分析軟件。構(gòu)建瑞香狼毒活性靶蛋白分子網(wǎng)絡,并展示分子網(wǎng)絡的核心分子、生物功能及信號通路。同時,利用IPA 自帶的查詢功能,以“Advanced HCC”為關(guān)鍵詞,從數(shù)據(jù)庫中查詢晚期肝細胞癌相關(guān)基因,構(gòu)建晚期肝細胞癌基因分子網(wǎng)絡,并展示分子網(wǎng)絡的核心分子、生物功能及信號通路。
本研究利用IPA 軟件中Comparison 模塊,比較二者的生物學通路,并選取共同作用的通路進行深入研究,分析二者在共同作用的生物學通路中的位點,預測瑞香狼毒治療晚期肝細胞癌的分子機制。
通過檢索,本研究共篩選出中藥瑞香狼毒4個活性成分,分別為胡蘿卜苷(daucosterol)、二氫山奈酚(dihydrokaempferol)、鵝掌楸樹脂酚(lirioresinol)、茴芹香豆精(pimpinellin)。其對應的靶蛋白共18個,從IPA 軟件中選出晚期肝細胞癌相關(guān)基因共40個(表1)。

表1 瑞香狼毒活性成分對應靶蛋白及晚期肝細胞癌相關(guān)基因
利用IPA 網(wǎng)絡分析功能,構(gòu)建瑞香狼毒活性成分靶蛋白及晚期肝細胞癌基因的分子網(wǎng)絡,圖中紅色標記為篩選出的靶蛋白分子或相關(guān)基因,灰色為構(gòu)建網(wǎng)絡圖參與分子(圖1、圖2)。
活性成分靶蛋白共構(gòu)建出3個分子相互作用網(wǎng)絡,參與分子最多的功能主要與組織損傷、機體異常及心血管疾病相關(guān),這些分子參與的信號通路主要為NOS相關(guān)信號通路、AMPK 信號通路、ERK/MAPK 信號通路、PPAR受體信號通路、PPAR信號通路、PI3K/AKT信號通路,圖1 展示了這些分子的相互關(guān)系特征。晚期肝細胞癌基因共構(gòu)建出6個分子相互作用網(wǎng)絡,圖2中主要展示了與癌癥、消化道疾病及肝臟疾病相關(guān)分子的相互關(guān)系特征。提示這些分子參與了肝臟腫瘤的調(diào)控,參與的信號通路主要為VEGF家族配體-受體互作信號通路、eNOS 信號通路、VEGF 信號通路、PDGF信號通路、PAK信號通路、NF-кB信號通路等。

圖1 瑞香狼毒靶蛋白分子網(wǎng)絡圖

圖2 晚期肝細胞癌相關(guān)基因分子網(wǎng)絡圖

圖3 瑞香狼毒靶蛋白和晚期HCC相關(guān)基因共同作用的信號通路
按照瑞香狼毒活性成分靶蛋白與作用通路相關(guān)性(-logP)從大到小進行排列,對比瑞香狼毒活性成分靶蛋白和晚期肝細胞癌相關(guān)基因作用的信號通路,前5 位共有信號轉(zhuǎn)導通路分別為cAMP 介導信號通路、G 蛋白偶聯(lián)受體信號通路、Gαq 信號通路、AMPK信號通路和PI3K/AKT信號通路(圖3)。
根據(jù)以上結(jié)果,重點觀察瑞香狼毒活性成分靶蛋白在PI3K 信號通路中的分子位點,在PI3K/AKT 信號通路中,紅色分子(PI3KCG、HSP90,PTGS2)是瑞香狼毒活性成分靶蛋白分子,灰色為晚期肝細胞癌相關(guān)基因分子(圖4)。

圖4 PI3K/AKT信號通路中作用位點
肝癌被列為全世界癌癥相關(guān)死亡率的第二大主要原因[16-17],盡管某些其他形式的癌癥治療取得了成功,但是在我國肝癌的發(fā)病率和死亡率都在迅速增加[18]。由于肝細胞癌早期缺乏特異性癥狀和精確的分子靶點,給肝細胞癌的早期診斷和治療帶來了嚴重障礙[19]。三分之二的肝細胞癌患者最初是在晚期被診斷出來的,此時幾乎沒有時間進行有效的治療。中藥在肝癌的治療中,特別是晚期肝細胞癌的治療過程中發(fā)揮著積極的作用。研究報道,瑞香狼毒許多成分在體內(nèi)外均具有抗腫瘤作用,其中總黃酮提取物具有較強的體內(nèi)和體外抗腫瘤作用,總木脂素有較強的體外抗腫瘤作用,香豆素類化合物是其特征性成分,不僅毒性強,而且有廣泛的藥理作用,二萜類化合物具有很強的抗癌活性,被公認為瑞香狼毒抗腫瘤作用的主要成分[20-21]。在本研究中,首先通過生物活性篩選,發(fā)現(xiàn)胡蘿卜苷(植物甾醇類)、二氫山奈酚(黃酮類)、鵝掌楸樹脂酚(木質(zhì)素類)、茴芹香豆精(香豆素類)為瑞香狼毒中的有效活性物質(zhì)成分,推測其可能為瑞香狼毒發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎。通過構(gòu)建有效活性成分靶蛋白和晚期肝細胞癌基因之間的分子網(wǎng)路,發(fā)現(xiàn)二者在參與分子以及分子功能中存在明顯差異。前者參與分子最多的功能要與組織損傷、機體異常及心血管疾病相關(guān)。而后者主要分子網(wǎng)絡則更多參與了癌癥、消化道疾病、肝臟疾病的調(diào)控。從各自獨立參與的信號通路看,既有相似,也存在明顯不同。其中,晚期肝癌相關(guān)基因主要通過血管生成信號通路,如VEGF 家族配體-受體互作信號通路、VEGF信號通路、PDGF信號通路促進了腫瘤的生長發(fā)育。綜合比較兩者共有的信號通路,結(jié)合文獻報道,推測PI3K/AKT 信號通路是二者共有的最重要信號信號通路[22-24]。PI3K/AKT 信號通路在多種細胞中活化,參與細胞增殖、分化、凋亡以及血管生成等[25-26]。靶向PI3K/AKT 信號通路信號通路是惡性腫瘤治療中的重要方法[27-28]。PI3KCG、HSP90、PTGS2 是瑞香狼毒活性靶蛋白中作用于PI3K/AKT 信號通路的重要分子,體外研究報道,MIR-502能通過誘導肝癌細胞周期停滯和凋亡,顯著抑制肝癌細胞的增殖和體內(nèi)腫瘤的生長,肝癌細胞中PI3KCG是mir-502 的直接下游靶點[29]。肝細胞hsp90 可能積極參與肝癌的發(fā)展,它可能是監(jiān)測晚期肝癌的潛在生物標志物及治療靶點[30]。而PTGS2 高表達與腫瘤晚期、腫瘤體積大、淋巴管侵犯增加、生存期短有關(guān),塞來昔布通過對PTGS2 靶向調(diào)控,能夠抑制肝癌細胞增殖、促進凋亡以及抑制侵襲性發(fā)生,表現(xiàn)出抗腫瘤活性[31]。因此,本研究推測瑞香狼毒可能通過PI3KCG、HSP90、PTGS2 三個分子調(diào)控PI3K/AKT 信號通路,抑制腫瘤血管生成,發(fā)揮抗腫瘤作用。
基于網(wǎng)絡藥理學和IPA 軟件進行網(wǎng)絡藥理學研究,探析中藥發(fā)揮作用的分子機制已得到了廣泛應用,為中藥藥理、組方機制及新藥研發(fā)等提供了有益的參考[32-34]。IPA 生物分析軟件能夠分析、整合、理解來自于基因表達等系統(tǒng)生物學、組學等的實驗數(shù)據(jù);能夠搜索到有關(guān)基因、蛋白質(zhì)、化學品和藥物的信息,并能建立起實驗系統(tǒng)的交互模型[35]。但其分析的基礎是基于其數(shù)據(jù)庫收錄的已有參考數(shù)據(jù),使用過程仍會存在解析信息不夠全面等不足。因此,提供更加全面,綜合的生物信息對于準確解析網(wǎng)絡藥理學數(shù)據(jù)將更有幫助[36]。