基于網(wǎng)絡藥理學探析瑞香狼毒活性成分治療晚期肝細胞癌的分子機制＊

魏飛力，吳夢麗，郭 麗，謝棒祥，杜宇瓊，陳德喜，劉曉霓

（1. 首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院 北京市肝病研究所 北京市肝炎與肝癌精準醫(yī)療及轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心 北京 100069；2. 首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院 北京 100069）

肝癌是我國常見的惡性腫瘤，近年來，發(fā)病率逐年上升，死亡率也位居前列[1]。多數(shù)肝癌患者在發(fā)現(xiàn)時已處于晚期，由于缺乏有效的治療措施，因此，晚期肝細胞癌在臨床治療中仍是一個亟待解決的難題[2]。在我國草藥被廣泛用于腫瘤防治，特別是在晚期肝細胞癌治療中，發(fā)揮著重要的作用。瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.）為瑞香科狼毒屬植物狼毒的干燥根，其治療腫瘤在我國古代醫(yī)學典籍中早有記載，近年來發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒中的許多成分在體內(nèi)外均具有抗腫瘤作用[3-9]，是一種潛在的抗腫瘤藥物，但其具體的抗腫瘤活性成分及作用機制目前尚不清楚。瑞香狼毒自身也具有明顯的毒性，有研究發(fā)現(xiàn)，隨著炮制方法的改變，瑞香狼毒中化學成分的含量及有效成分均發(fā)生著相應的變化，導致其毒性程度也作出相應改變，因此在臨床中使用十分謹慎[10-14]。如果能探明瑞香狼毒的活性成分，明確其治療晚期肝細胞癌的作用機制，對于瑞香狼毒增效減毒，開發(fā)利用以及晚期肝細胞癌的治療都具有重要的意義。本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法，通過篩選瑞香狼毒的活性成分，利用IPA 軟件，預測其治療晚期肝細胞癌的分子及信號通路，為探索其多靶點治療晚期肝細胞癌的機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 瑞香狼毒活性成分篩選

通過檢索TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/），在“Herb name”詞條框中輸入“瑞香狼毒”，點擊search，獲取單味中藥化合物條目，點擊進入并獲取中藥分子信息，包括活性成分的分子名（molecule name）、相對分子質(zhì)量（MW）、類藥性（DL）、口服生物利用度（OB，%）、小腸上皮細胞滲透率（Caco-2）[15]。本研究中瑞香狼毒選用以化合物的口服生物利用度（OB）≥10%，化合物的類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件。

1.2 活性成分對應靶蛋白信息獲取

根據(jù)1.1項下篩選出符合條件的活性成分，在TCMSP 平臺中，點擊“Related Targets”，獲取成分的“Targets Infomation”，從獲取的信息中得到該成分作用的靶蛋白名（targetname=protein names），在Uniprot（universal protein knowledgebase）（www.Uniprot.org）中，使用Uniprot KB 檢索功能，在檢索框中輸入靶蛋白名（target name），檢索條件為“organism:homo sapiens 和reviewed: yes”，獲取基因名（gene name），該部分數(shù)據(jù)中包括中藥活性成分中對應人類的相關(guān)靶蛋白。

1.3 構(gòu)建瑞香狼毒活性成分靶蛋白及晚期肝細胞癌基因分子網(wǎng)絡

將檢索到的瑞香狼毒活性成分對應的靶蛋白在線提交至Ingenuity Pathway Analysis（IPAhttp://www.ingenuity.com/）生物分析軟件。構(gòu)建瑞香狼毒活性靶蛋白分子網(wǎng)絡，并展示分子網(wǎng)絡的核心分子、生物功能及信號通路。同時，利用IPA 自帶的查詢功能，以“Advanced HCC”為關(guān)鍵詞，從數(shù)據(jù)庫中查詢晚期肝細胞癌相關(guān)基因，構(gòu)建晚期肝細胞癌基因分子網(wǎng)絡，并展示分子網(wǎng)絡的核心分子、生物功能及信號通路。

1.4 比對瑞香狼毒活性成分靶蛋白及晚期肝細胞癌基因共同作用的生物學通路及作用位點

本研究利用IPA 軟件中Comparison 模塊，比較二者的生物學通路，并選取共同作用的通路進行深入研究，分析二者在共同作用的生物學通路中的位點，預測瑞香狼毒治療晚期肝細胞癌的分子機制。

2 結(jié)果

2.1 瑞香狼毒活性成分對應靶蛋白及晚期肝細胞癌相關(guān)基因

通過檢索，本研究共篩選出中藥瑞香狼毒4個活性成分，分別為胡蘿卜苷（daucosterol）、二氫山奈酚（dihydrokaempferol）、鵝掌楸樹脂酚（lirioresinol）、茴芹香豆精（pimpinellin）。其對應的靶蛋白共18個，從IPA 軟件中選出晚期肝細胞癌相關(guān)基因共40個（表1）。

表1 瑞香狼毒活性成分對應靶蛋白及晚期肝細胞癌相關(guān)基因

2.2 瑞香狼毒活性成分對應靶蛋白及晚期肝細胞癌基因分子網(wǎng)絡

利用IPA 網(wǎng)絡分析功能，構(gòu)建瑞香狼毒活性成分靶蛋白及晚期肝細胞癌基因的分子網(wǎng)絡，圖中紅色標記為篩選出的靶蛋白分子或相關(guān)基因，灰色為構(gòu)建網(wǎng)絡圖參與分子(圖1、圖2)。

活性成分靶蛋白共構(gòu)建出3個分子相互作用網(wǎng)絡，參與分子最多的功能主要與組織損傷、機體異常及心血管疾病相關(guān)，這些分子參與的信號通路主要為NOS相關(guān)信號通路、AMPK 信號通路、ERK/MAPK 信號通路、PPAR受體信號通路、PPAR信號通路、PI3K/AKT信號通路，圖1 展示了這些分子的相互關(guān)系特征。晚期肝細胞癌基因共構(gòu)建出6個分子相互作用網(wǎng)絡，圖2中主要展示了與癌癥、消化道疾病及肝臟疾病相關(guān)分子的相互關(guān)系特征。提示這些分子參與了肝臟腫瘤的調(diào)控，參與的信號通路主要為VEGF家族配體-受體互作信號通路、eNOS 信號通路、VEGF 信號通路、PDGF信號通路、PAK信號通路、NF-кB信號通路等。

圖1 瑞香狼毒靶蛋白分子網(wǎng)絡圖

圖2 晚期肝細胞癌相關(guān)基因分子網(wǎng)絡圖

圖3 瑞香狼毒靶蛋白和晚期HCC相關(guān)基因共同作用的信號通路

2.3 瑞香狼毒靶蛋白和晚期肝細胞癌基因共同作用的信號通路比較

按照瑞香狼毒活性成分靶蛋白與作用通路相關(guān)性（－logP）從大到小進行排列，對比瑞香狼毒活性成分靶蛋白和晚期肝細胞癌相關(guān)基因作用的信號通路，前5 位共有信號轉(zhuǎn)導通路分別為cAMP 介導信號通路、G 蛋白偶聯(lián)受體信號通路、Gαq 信號通路、AMPK信號通路和PI3K/AKT信號通路(圖3)。

2.4 信號通路作用分子位點比較

根據(jù)以上結(jié)果，重點觀察瑞香狼毒活性成分靶蛋白在PI3K 信號通路中的分子位點，在PI3K/AKT 信號通路中，紅色分子（PI3KCG、HSP90，PTGS2）是瑞香狼毒活性成分靶蛋白分子，灰色為晚期肝細胞癌相關(guān)基因分子（圖4）。

圖4 PI3K/AKT信號通路中作用位點

3 討論

肝癌被列為全世界癌癥相關(guān)死亡率的第二大主要原因[16-17]，盡管某些其他形式的癌癥治療取得了成功，但是在我國肝癌的發(fā)病率和死亡率都在迅速增加[18]。由于肝細胞癌早期缺乏特異性癥狀和精確的分子靶點，給肝細胞癌的早期診斷和治療帶來了嚴重障礙[19]。三分之二的肝細胞癌患者最初是在晚期被診斷出來的，此時幾乎沒有時間進行有效的治療。中藥在肝癌的治療中，特別是晚期肝細胞癌的治療過程中發(fā)揮著積極的作用。研究報道，瑞香狼毒許多成分在體內(nèi)外均具有抗腫瘤作用，其中總黃酮提取物具有較強的體內(nèi)和體外抗腫瘤作用，總木脂素有較強的體外抗腫瘤作用，香豆素類化合物是其特征性成分，不僅毒性強，而且有廣泛的藥理作用，二萜類化合物具有很強的抗癌活性，被公認為瑞香狼毒抗腫瘤作用的主要成分[20-21]。在本研究中，首先通過生物活性篩選，發(fā)現(xiàn)胡蘿卜苷（植物甾醇類）、二氫山奈酚（黃酮類）、鵝掌楸樹脂酚（木質(zhì)素類）、茴芹香豆精（香豆素類）為瑞香狼毒中的有效活性物質(zhì)成分，推測其可能為瑞香狼毒發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎。通過構(gòu)建有效活性成分靶蛋白和晚期肝細胞癌基因之間的分子網(wǎng)路，發(fā)現(xiàn)二者在參與分子以及分子功能中存在明顯差異。前者參與分子最多的功能要與組織損傷、機體異常及心血管疾病相關(guān)。而后者主要分子網(wǎng)絡則更多參與了癌癥、消化道疾病、肝臟疾病的調(diào)控。從各自獨立參與的信號通路看，既有相似，也存在明顯不同。其中，晚期肝癌相關(guān)基因主要通過血管生成信號通路，如VEGF 家族配體-受體互作信號通路、VEGF信號通路、PDGF信號通路促進了腫瘤的生長發(fā)育。綜合比較兩者共有的信號通路，結(jié)合文獻報道，推測PI3K/AKT 信號通路是二者共有的最重要信號信號通路[22-24]。PI3K/AKT 信號通路在多種細胞中活化，參與細胞增殖、分化、凋亡以及血管生成等[25-26]。靶向PI3K/AKT 信號通路信號通路是惡性腫瘤治療中的重要方法[27-28]。PI3KCG、HSP90、PTGS2 是瑞香狼毒活性靶蛋白中作用于PI3K/AKT 信號通路的重要分子，體外研究報道，MIR-502能通過誘導肝癌細胞周期停滯和凋亡，顯著抑制肝癌細胞的增殖和體內(nèi)腫瘤的生長，肝癌細胞中PI3KCG是mir-502 的直接下游靶點[29]。肝細胞hsp90 可能積極參與肝癌的發(fā)展，它可能是監(jiān)測晚期肝癌的潛在生物標志物及治療靶點[30]。而PTGS2 高表達與腫瘤晚期、腫瘤體積大、淋巴管侵犯增加、生存期短有關(guān)，塞來昔布通過對PTGS2 靶向調(diào)控，能夠抑制肝癌細胞增殖、促進凋亡以及抑制侵襲性發(fā)生，表現(xiàn)出抗腫瘤活性[31]。因此，本研究推測瑞香狼毒可能通過PI3KCG、HSP90、PTGS2 三個分子調(diào)控PI3K/AKT 信號通路，抑制腫瘤血管生成，發(fā)揮抗腫瘤作用。

基于網(wǎng)絡藥理學和IPA 軟件進行網(wǎng)絡藥理學研究，探析中藥發(fā)揮作用的分子機制已得到了廣泛應用，為中藥藥理、組方機制及新藥研發(fā)等提供了有益的參考[32-34]。IPA 生物分析軟件能夠分析、整合、理解來自于基因表達等系統(tǒng)生物學、組學等的實驗數(shù)據(jù)；能夠搜索到有關(guān)基因、蛋白質(zhì)、化學品和藥物的信息，并能建立起實驗系統(tǒng)的交互模型[35]。但其分析的基礎是基于其數(shù)據(jù)庫收錄的已有參考數(shù)據(jù)，使用過程仍會存在解析信息不夠全面等不足。因此，提供更加全面，綜合的生物信息對于準確解析網(wǎng)絡藥理學數(shù)據(jù)將更有幫助[36]。