基于BMP-Smad/RUNX2信號通路探討固本增骨方含藥血清對大鼠BMSCs增殖和成骨分化的影響＊

宋 敏，鞏彥龍，董 平，2，董萬濤，蔣林博

（1. 甘肅中醫藥大學 蘭州 730000；2. 內蒙古醫科大學 呼和浩特 010110；3. 甘肅中醫藥大學附屬醫院 蘭州730020；4. 深圳市羅湖區中醫院 深圳 518000）

骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的終末分化細胞是成骨細胞（Osteoblasts，OB），現有的研究已知OB 和破骨細胞（Osteoclast，OC）之間的動態平衡，在維持骨微結構和骨內穩態方面具有關鍵作用[1]，這些細胞參與多種骨病尤其是骨質疏松癥（Osteoporosis，OP）的病理生理過程。隨著年齡的不斷增加，性激素缺乏等多種因素造成OB 與OC 間動態平衡關系被破壞，表現為骨破壞增加而骨形成減少，這在老年女性中最常見，但男性也有較高的風險[2]。

雖然OP 被認為是老化的預測結果，但它是可以避免和可治療的。在過去的幾十年中，主要是通過應用雙膦酸鹽阻止骨吸收，近年來，更多研究的注意力集中在通過促進骨形成方法來治療OP，現有治療OP的西藥主要包括抗骨吸收和促進骨合成的作用，盡管這些藥物在防治OP 的機制中有一定的改進，但是由于擔心抗再吸收藥物的異常副作用，以及缺乏對維持其長期有效性的確認，導致許多患者不易接受這些藥物[3]。而中醫藥通過對機體的整體調節防治OP，療效顯著、副作用小，對OP 的防治有積極作用。近年，基于誘導BMSCs 向成骨細胞分化治療OP 已成為治療骨質疏松癥的一種方法[4]。本實驗研究通過體外建立大鼠BMSCs 定向誘導向OB 分化的模型，運用固本增骨方含藥血清進行干預，觀察固本增骨方對大鼠BMSCs增殖及成骨分化過程的影響并探討其可能的機制。

1 材料

1.1 動物與細胞

3月齡SPF 級Wistar 大鼠30 只，雌雄各半，體重（200±20）g，由甘肅中醫藥大學動物實驗中心提供，在SPF級動物實驗室飼養，光線晝夜交替各12 h，實驗室溫度：（22 ± 2）℃，濕度：（55 ± 5）%，給予實驗室專用純凈水及飼料喂養，每2天更換墊料1次。Wistar大鼠BMSCs（廣州賽業生物科技有限公司提供，貨號：RAWMX-01001）。

1.2 藥品與試劑

固本增骨方主要成分：炙黃芪、岷當歸、燙狗脊等，由甘肅中醫藥大學附屬醫院藥劑科提供。將上方煎煮、濃縮后制成粉末，生理鹽水配制成25 g·L-1混懸液。BMSCs 完全培養基、BMSCs 成骨誘導分化完全培養基、0.1% 明膠（RAWMX-90011，RAWMX-90021，T170313G001），廣州賽業生物科技有限公司；堿性磷酸酶染液（T170512G001），廣州賽業生物科技有限公司提供；BGP ELISA 試劑盒（MM-0700R2）、COL-I ELISA 試 劑 盒（MM-0665R2）、OPN ELISA 試 劑 盒（MM-0701R2）、ALP ELISA 試劑盒（MM-0217R2），酶免公司提供。RIZOI 試劑（94206），美國ambion 公司；逆轉錄、熒光定量試劑盒（0000238439）美國Promega公司；PCR 引物（CHPQ332），大連寶生物工程有限公司。

1.3 儀器

二氧化碳培養箱（MCO-18AIC[UV]），日本SANYO公司；低溫高速離心機（D37520），美國Kendro 公司；PCR熒光定量儀（C1000），美國BIO-RAD公司。

2 方法

2.1 固本增骨方含藥血清的制備

大鼠適應性喂養1 周后，隨機分為2 組，空白血清組10 只、含藥血清組20 只。依據人與大鼠“體表面積換算法”，按臨床等效劑量給藥，含藥血清組按照10 ml·kg-1固本增骨方混懸液灌胃，空白血清組給予相同體積生理鹽水。連續給藥7 天，早晚各1 次。末次給藥2 h后，10%水合氯醛麻醉大鼠，心臟取血，3000 rpm離心15 min取血清，過濾除菌后，-20℃保存備用。

2.2 Wistar大鼠BMSCs的培養

復蘇BMSCs，將其用0.25%胰蛋白酶、0.04%EDTA 消化液在37℃消化2 min 左右后，吸取細胞懸液至離心管，離心機設置3000 rpm 離心5 min，去掉上清，加入培養基重懸。臺盼藍染色行活細胞計數，以3.0 × 104個活細胞/cm2密度將細胞接種分瓶后置入37℃、5% CO2培養箱中繼續傳代培養，最終培養出符合實驗要求的BMSCs。

2.3 分組與造模

挑選長勢優良的P3 代BMSCs，隨機分為6 組：依次為空白血清組，傳統成骨誘導組，5%含藥血清組、10%含藥血清組、20%含藥血清組、30%含藥血清組。將P3 代BMSCs 分別接種于5 塊96 孔培養板，每孔依次加入200 ul BMSCs 完全培養基，每組5孔，后置于飽和濕度培養箱培養24 小時，并吸棄掉各孔培養基，按實驗分組依次向5 塊培養板加入空白血清、傳統成骨誘導培養基（含體積分數10%胎牛血清、100 U·ml-1青霉素和100 mg·ml-1鏈霉素、抗環血酸50 mg·L-1，β-甘油 磷 酸 鈉10 mmol·L-1、地 塞 米 松10-7mol·L-1的LDMEM 培養基）[5]、（5%、10%、20%、30%）含藥血清繼續培養。24 h 后對各組細胞測量計數，每天檢測1 塊培養板，連續5天。

2.4 大鼠BMSCs增殖的檢測

向上述各組加入相應培養液，24 小時后測量6 組細胞計數，每天測一塊96 孔板，連續檢測4 天。向孔板每孔內加入MTT及培養液，置37%培養箱繼續培養4 h，后吸去培養液，加入DMSO 甘氨酸緩沖液，搖床振蕩10 min后，用酶標儀在490 nm波長處測量OD值，依次測定各組細胞的相對增殖率。

圖1 P1、P2、P3代BMSCs鏡下形態×10

表1 組間OD值比較（±s）

表1 組間OD值比較（±s）

注：與空白組比較▲P＞0.05，與空白組及傳統成骨誘導組比較ΔP＜0.05，與傳統成骨誘導組比較■P＜0.05，與5%、10%及30%含藥血清組□P＜0.05。

120hOD值0.394±0.051Δ■0.459±0.228Δ■0.667±0.054Δ■□0.541±0.062Δ■0.435±0.0460.473±0.022Δ組別5%含藥血清組10%含藥血清組20%含藥血清組30%含藥血清組空白組傳統成骨誘導組24hOD值0.078±0.001Δ 0.103±0.012Δ 0.108±0.035Δ 0.106±0.004Δ 0.074±0.0010.072±0.002▲48hOD值0.093±0.011Δ■0.273±0.054Δ■0.362±0.013Δ■□0.202±0.012Δ■0.067±0.0110.090±0.012Δ 72hOD值0.426±0.050Δ■0.453±0.026Δ■0.612±0.123Δ■□0.419±0.114Δ■0.363±0.0720.414±0.107Δ 96hOD值0.479±0.041Δ■0.506±0.043Δ■0.705±0.163Δ■□0.546±0.091Δ■0.466±0.0230.476±0.061Δ

2.5 堿性磷酸酶染色

成骨誘導2周后，吸棄培養基，4%中性甲醛固定，按堿性磷酸酶染色試劑盒說明書進行染色、固定，光鏡下觀察各組細胞藍紫色區域的密集程度。

2.6 BMSCs成骨標志蛋白的檢測

分別取空白對照組、傳統誘導組、固本增骨含藥血清（5%、10%、20%、30%）組1 × 106BMSCs，在4℃用PBS 洗滌細胞3 次，加入的RIPA 裂解液（含1%PMSF），于冰上裂解30分鐘，后收集細胞裂解物，設置12000 rpm、離心10 分鐘，吸取上清液。按ELISA 試劑盒說明書步驟，檢測一型膠原蛋白（COL-I）、堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣蛋白（BGP）、骨橋蛋白（OPN）四種蛋白OD 值，根據標準品濃度及所對應OD 值，繪制每組蛋四種蛋白的標準曲線（R＞0.99），后根據函數式計算各組四種蛋白的濃度，并進行統計分析。

2.7 BMPs信號通路相關基因的檢測

取空白對照血清組、（5%、10%、20%、30%）濃度含藥血清，培養7 天，采用trizol 法提取總RNA，核酸蛋白儀檢測總RNA 的濃度及純度，按照逆轉錄試劑盒說明書操作。設計引物及反應體系。后在RT-PCR儀上進行反應。檢測樣本的中BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2的CT值。根據各組樣本CT值與2-ΔΔCT值，進行統計分析。

2.8 統計學方法

采用SPSS22.0 統計軟件進行數據處理。計量資料以均數加減標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析法，LSD 方法進行多組間比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 BMSCs培養結果

BMSCs P1 代培養1 天后，鏡下觀察可見細胞呈圓形且折光性強；培養5 天小時后，見形態呈條柱狀、分叉狀貼壁生長；P2、P3 代培養5 天后見細胞增殖分裂加快，逐漸呈纖維細胞長梭狀形態，結果見圖1。

3.2 各組BMSCs的增殖

在最初24 h 傳統成骨誘導組與空白組OD 值比較差異無統計學意義（P＞0.05），但各含藥血清組與傳統成骨誘導組及空白組OD 值比較差異具有統計學意義（P＜0.05）；后面四個時間點各藥物組OD 值與空白組比較差異均具有統計學意義（P＜0.05）；各含藥血清組與空白組及傳統成骨誘導組（何為傳統成骨誘導？）OD 值比較差異均具有統計學意義（P＜0.05），且20%含藥血清組與5%、10%及30%含藥血清組OD 值比較差異具有統計學意義（P＜0.05），結果見表1。

3.3 各組細胞堿性磷酸酶染色結果比較

堿性磷酸酶染色后鏡下觀察可見各濃度固本增骨膠囊含藥血清組及傳統誘導組細胞呈現藍紫色染色陽性區，且藍紫色染色陽性區隨含藥血清濃度增加染色區域逐漸密集，在濃度為20%時染色區域最密集，當濃度為30%時，染色區域減少，結果見圖2。

圖2 各組細胞堿性磷酸酶染色結果100×

3.4 各組BMSCs 成骨標志蛋白BGP、OPN、ALP、COL-I含量

5%、10%、20%含藥血清組與其他各組比較，BGP、OPN、ALP、COL-I四種成骨標志蛋白含量具有明顯差異（P＜0.05），其中20%含藥血清組與5%、10%含藥血清組之間差異具有統計學意義（P＜0.05），而30%含藥血清組與空白組及傳統成骨誘導組比較，四種成骨標志蛋白含量無明顯差異（P＞0.05），傳統成骨誘導組與空白組四種成骨標志蛋白含量比較無明顯差異（P＞0.05），結果見表2。

表2 各組BMSCs成骨標志蛋白含量比較（±s，μg/L）

表2 各組BMSCs成骨標志蛋白含量比較（±s，μg/L）

注：與30%含藥血清組、空白組及傳統成骨誘導組比較▲P＜0.05，與5%、10%含藥血清組ΔP＜0.05，與空白組及傳統成骨誘導組比較■P＞0.05，與空白組比較P＞0.05。

COL-I 15.934±3.544▲21.38±3.627▲25.34±5.239▲Δ 6.479±1.253■6.097±0.8956.448±1.002□組別5%含藥血清組10%含藥血清組20%含藥血清組30%含藥血清組空白組傳統成骨誘導組BGP 7.493±1.986▲7.992±1.91▲9.509±2.393▲Δ 1.405±0.328■1.468±0.2701.611±0.389□OPN 16.551±3.094▲18.405±2.149▲21.773±8.064▲Δ 1.648±0.725■1.645±0.2771.778±0.322□ALP 22.829±1.472▲26.63±4.652▲27.804±4.358▲Δ 6.266±0.133■6.145±0.0336.186±0.101□

3.5 各組細胞BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2 mRNA表達比較

20%含藥血清組與其他各組蛋白表達比較有顯著差異（P＜0.05），5%、10%及30%含藥血清組與空白組及傳統成骨誘導蛋白表達比較無明顯差異（P＞0.05），傳統成骨誘導組與空白組蛋白表達比較無明顯差異（P＞0.05），結果見表3。

4 討論

OP是一種多因素疾病，其表現為骨量減少和骨微結構變化，導致典型的低能量脆性骨折發生率增加[6]。人口老齡化對OP 的發生和進展具有巨大的影響，這在絕經后婦女中更為明顯，其中骨轉換的比例隨著雌激素的缺乏而增加，并導致持續的骨損傷[7]。據統計全世界有2 億多人患有骨質疏松癥，50 歲以上的女性中近1/2 和男性中近1/5 可能發生骨折[8]。治療OP 的目的是減少骨丟失，維持骨密度，新療法如基于BMSCs 高成骨分化能力為基礎的治療，能通過增加患者缺失的礦物質密度和駐留BMSCs 的數量及其功能返回[9]，可運用不同方式誘導BMSCs 向成骨增殖和分化，BMSCs 向成骨細胞的生成和對破骨細胞的抑制可減少骨密度損失[10]，阻止骨質疏松，進而降低OP 骨折發生率。已有的研究顯示[11]將異基因BMSCs 注射在去卵巢OP 大鼠模型或糖皮質激素誘導OP 大鼠模型中，都能刺激OB 的發生和連續持續的骨形成，而改變了骨量和骨強度，這是不同因素的作用誘導BMSCs 向OB 分化和BMSCs 的作用使OB 的成骨作用增強，但是如何有效的誘導BMSCs 在體內外向OB 分化并促進其成骨作用，仍然有多種不確定的因素。研究顯示[12-14]，中醫藥可以調控基因、信號通路、細胞因子等多途徑誘導BMSCs 向OB 分化并促進其成骨作用。本實驗研究運用固本增骨方含藥血清進行干預BMSCs 誘導其向OB 分化，觀察固本增骨方對大鼠BMSCs 增殖及成骨分化過程的影響并探討其可能的機制。

表3 各組細胞BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2 mRNA表達比較（±s）

表3 各組細胞BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2 mRNA表達比較（±s）

注：與其他各組比較▲P＜0.05，與空白組及傳統成骨誘導組比較ΔP＞0.05，與空白組比較■P＞0.05。

RUNX21.144±0.287Δ 1.282±0.391Δ 1.825±0.103▲1.061±0.113Δ 0.932±0.0840.968±0.119■組別5%含藥血清組10%含藥血清組20%含藥血清組30%含藥血清組空白組傳統成骨誘導組BMP21.053±0.259Δ 1.171±0.264Δ 1.776±0.381▲1.015±0.152Δ 0.923±0.1280.993±0.270■BMP41.163±0.012Δ 1.252±0.014Δ 1.72±0.049▲1.009±0.021Δ 0.958±0.2200.981±0.080■Smad11.09±0.15Δ 1.32±0.19Δ 1.84±0.45▲1.017±0.09bΔ 0.94±0.010.94±0.02■

BMSCs 的增殖情況來看，各組固本增骨方含藥血清組在培養24小時后比空白組及傳統成骨誘導組OD值比較差異均具有統計學意義（P＜0.05），說明且固本增骨方含藥血清能促進BMSCs增殖，并且在20%含藥血清組較5%、10%及30%含藥血清組OD 值比較差異具有統計學意義（P＜0.05），說明20%含藥血清對BMSCs 增殖最具促進作用，堿性磷酸酶染色后鏡下觀察細胞增殖情況，也印證了這一結果，可見藍紫色陽性區隨含藥血清濃度增加染色而逐漸逐漸密集，在濃度為20%時染色區域最密集，當濃度為30%時，染色區域減少。BGP、OPN、ALP、COL-I 是成骨標志蛋白，非膠原蛋白BGP 是骨形成的特異性標志物，其能夠抑制異常的羥磷灰石結晶的形成及軟骨的礦化速率，進而維持骨量、參與骨重塑[15]；ALP 在誘導BMSCs 向OB分化及維持骨代謝平衡過程中具有重要的意義[16]；OPN 可能是影響絕經后婦女腰椎骨量丟失的關鍵因子[17]；COL-I 的結果、含量及穩定性改變，與OP 的發生關系密切[18]；本實驗結果顯示，5%、10%、20%含藥血清組與其他各組BGP、OPN、ALP、COL-I 含量比較有統計學意義（P＜0.05），且20%含藥血清組與5%、10%含藥血清組比較有統計學意義（P＜0.05），說明20%含藥血清組最具有促進BMSCs 成骨的作用。BMPSmad信號通路在成骨細胞增殖、遷移及促進骨形成過程中起著關鍵作用，其與OP 的發生、發展關系密切，Smad 參與了BMP（包括BMP2、BMP4）對RUNX2 表達的上調，研究顯示，原硅酸誘導BMSCs 向成骨細胞分化及成骨過程中，BMP-Smad/RUNX2信號通路的活化促進BGP、OPN、COL-I 的合成[19]，本實驗結果顯示，20%含藥血清組與其他各組BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2 mRNA 表達比較差異均具有統計學意義（P＜0.05），說明20% 含藥血清組能促進BMSCs 成骨BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2 mRNA的表達。

目前西醫對OP 的治療通過抑制骨吸收和促進骨形成，這些西藥又有不同程度的不良反應、患者依從性差等。固本增骨方是甘肅中醫藥大學宋敏教授經驗方，由道地中藥材炙黃芪、岷當歸、燙狗脊等組成，治療OP 以整體觀念、辨證論治為原則，具有服用方便，療效穩定，副作用小等優點，具有益氣健脾、補腎壯骨、活血通絡之功效，標本兼顧，能有效緩解老年脾腎兩虛型骨質疏松癥狀[20-21]。本實驗研究結果顯示，固本增骨方能促進BMSCs 的增殖，并且能促進成骨標志蛋白BGP、OPN、ALP、COL-I 蛋白含量的增加，這個機制可能是激活了BMP-Smad/RUNX2 信號通路實現的。