北沙參異戊烯基轉移酶GlIPT1基因的克隆及生物信息學分析＊

陳泓宇，任宏偉，張玉喜，王衛青，譚玲玲，高 婷，

（1. 青島農業大學生命科學學院山東省高校植物生物技術重點實驗室 青島 266109；2. 上海市資源植物功能基因組學重點實驗室 上海 116021）

北沙參Glehniae Radix，是我國傳統中藥材之一，其性甘、微苦，有養陰潤燥、清肺化痰、益胃生津的功效，為“補肺之要藥”[1]。此外，北沙參還具有祛熱鎮痛、抗菌、抗癌、抗高血壓、抗HIV、增強免疫等作用[2]。目前，霧霾多發、污染嚴重，北沙參作為藥食兩用的常見藥材受到廣泛關注。北沙參的基原植物為珊瑚菜Glehnia littoralis，屬于傘形科珊瑚菜屬Glehnia，珊瑚菜野生種瀕臨滅絕，為中國珍稀瀕危保護植物（漸危）[3]。珊瑚菜為本屬單種植物，在傘形科中有獨特的生態類型及重要的起源與演化地位[4]。

北沙參中的重要活性成分為香豆素類，主要有歐前胡素（Imperatorin，IMP）、異歐前胡素（Isoimperatorin，ISOIMP）、補骨脂素（Psoralen，PS）等[5-6]。眾多研究證明，香豆素類化合物具有多種生物活性，已應用于臨床[7-8]，如歐前胡素具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、鎮痛以及擴張血管等功效[9]；歐前胡素及異歐前胡素均具有顯著的鎮痛及抗菌作用[10]；補骨脂素具有鎮靜、止血等功效[11]。雖然珊瑚菜香豆素療效顯著，應用廣泛，潛在社會需求量大，但是天然藥材中香豆素類含量較低。應用現代生物技術調控珊瑚菜中香豆素的生物合成代謝能有效解決該問題，因此，開展珊瑚菜的香豆素類生物合成途徑研究具有前瞻性。

圖1 珊瑚菜香豆素可能的生物合成途徑

香豆素的含量和組分主要受生物合成途徑中的關鍵酶及其表達水平的調控。目前，苯丙烷類代謝途徑作為香豆素類化合物合成的上游研究的較為深入，但香豆素類化合物生物合成途徑和該途徑的關鍵代謝酶尚未被闡明。圖1是推測的珊瑚菜香豆素生物合成途徑示意圖。莽草酸通過分枝酸、預苯酸經轉氨作用形成苯丙氨酸，從而進入苯丙烷類代謝途徑，經苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanin Ammonia-lyase，PAL）作用生成肉桂酸，經肉桂酸4-羥化酶（Cinnamate-4-hydroxylase，C4H）作用生成對羥基桂皮酸，酶解環化生成傘形花內酯，在傘形花內酯二甲基烯丙基轉移酶（Umbelliferone dimethylallyltransferase，UDT）作用下形成2-甲基軟木花椒素，由異紫花前胡內酯合成酶（Marmesin synthase，MS）催化產生異紫花前胡內酯，進而在補骨脂素合成酶（Psoralen synthase，PS）作用下形成補骨脂素，再通過補骨脂素單加氧酶（Psoralen monooxygenase，PMO）分別生成花椒毒酚和佛手柑內酯，二者在異戊烯基轉移酶（Isoprenyltransferase，IPT）作用下分別生成歐前胡素和異歐前胡素，同時在甲基轉移酶（Methyltransferase，MT）作用下最終形成異茴芹內酯。其中，IPT 是北沙參香豆素合成途徑的最后一步關鍵酶，其直接催化北沙參的重要香豆素活性成分歐前胡素及異歐前胡素的合成。目前，國內外對北沙參的香豆素生物合成基因研究還比較少，GenBank 登錄的相關mRNA 序列僅PAL、BMT、CHS及本課題組前期克隆的C4H、4CL、PS、UDT 基因[12-13]，而IPT 未見研究。IPT基因最早在根癌農桿菌中發現[14]。異戊烯基轉移酶在植物中屬于小基因家族，擬南芥有9個，水稻有10個，蘋果有10個[15]。人參、丹參、東北紅豆杉、苦參、粗毛淫羊藿等藥用植物中也克隆了IPT同源基因[16-17]。大多數研究顯示，植物IPT是與細胞分裂素合成相關的基因[18]，同時，也有證據表明IPT 的表達和植物次生代謝產物的積累有關[19]。

目前，本草基因組學發展迅速[20]，國內外已經開展青蒿、丹參、西洋參等多種藥用植物的大規模轉錄組研究。本研究在前期本課題組已有的珊瑚菜轉錄組數據（序列號：PRJNA387325）基礎上，通過進一步數據庫注釋和表達量分析，初步篩選了5 條參與北沙參香豆素合成的關鍵酶異戊烯基轉移酶（IPT）候選基因：c41865_g1、c60807_g1、c61200_g1、c65981_g2、c94067_g1。茉莉酸甲酯作為重要的生物誘導物質在植物應答外界脅迫以及生長發育中發揮重要作用[21]，植物常見的抵御外來脅迫的方式是通過自身產生多種次生代謝物質。外施茉莉酸類化合物能有效刺激植物次生代謝過程，可引起植物次生代謝產物的積累[22]。已有研究表明，茉莉酸甲酯能夠有效的促進明黨參中香豆素類化合物的合成[23]。

為了進一步探究這5 條IPT 候選基因是否參與了北沙參的次生代謝過程，本研究使用茉莉酸甲酯作為誘導劑處理的珊瑚菜幼苗葉，篩選處理后表達量明顯變化的基因，即參與北沙參香豆素次生代謝途徑的IPT 基因。在轉錄組數據基礎上，利用分子生物學手段對該基因進行了全長克隆并初步進行生物信息學和表達模式分析。本研究有利于北沙參香豆素類生物合成分子機制的解析，同時對中藥材次生代謝研究具有示范意義。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

本研究的主要儀器包括：5424 小型臺式離心機（德國Eppendorff Centrifuge 公司）；實時熒光定量PCR儀（美國ABI 公司）；SIM-F140AY65 制冰機（日本三洋公司）；Tanon500 凝膠成像分析儀（上海領成公司）；核酸電泳系統（美國BIO-RAD 公司）；壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安公司）。

本研究的主要試劑包括：植物多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；SMARTer? RACE5′/3′Kit 試劑盒（大連寶生生物工程有限公司）；SYBR? PremixEx Taq ?II（TLi RNaseH PLus）定量試劑盒（大連寶生生物工程有限公司）；TIAN Midi Purification Kit 瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（上海生工有限公司）。

1.2 實驗材料

本研究的實驗材料選取山東省青島農業大學植物生物技術重點實驗室栽培的珊瑚菜無菌苗若干株（2019年3月）。處理后每株取1-2 片真葉，液氮速凍，-80℃保存。

1.3 方法

1.3.1 珊瑚菜組培苗制備

選取7、8月份收獲的北沙參新鮮種子，曬干后，裝入容器自來水流水浸泡過夜，次日倒掉多余的水分，將種子裝入黑色塑料袋中封口，4℃低溫黑暗處理3-4個月。約3個月后，在北沙參種子的凹面處可見一個凸起膨脹的點，用解剖刀小心翼翼的刮去種子上的果殼及殘留物，備用。在無菌臺內，升汞消毒清洗后用解剖刀在種子凹面中軸輕輕割一道傷口，傷口深度不可太深，亦不割到種子內部的胚。用兩把解剖刀在種子凹面中軸兩側輕輕施加壓力，使得北沙參種子從中軸傷口處裂開，分成均勻兩半。此時肉眼可見長條狀的胚結構，用解剖針將胚從種子中取出，放置在組培瓶或錐形瓶中的MS培養基上。封口，置于光照培養箱中培養。

培養條件：光照16 h，溫度25℃。黑暗8 h，溫度22℃。北沙參胚放入MS培養基15天左右即可成苗。

1.3.2 茉莉酸甲酯處理

取生長狀況良好的北沙參無菌苗，實驗組與對照組各5 株。預實驗確定實驗組使用濃度為200 μmol/L的茉莉酸甲酯稀釋液，浸泡10 s，室溫黑暗環境放置16 h 備用。因茉莉酸甲酯以無水乙醇為助劑[22]，為消除無水乙醇的影響，在對照樣品中加入等量無水乙醇，同樣室溫黑暗放置16 h。處理后的材料每株選取1-2 片真葉，放入EP 管中在液氮中速凍，以備進行RNA提取。

1.3.3 總RNA提取

本研究利用北京天根生化科技有限公司的植物多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒，分別提取珊瑚菜實驗樣品與對照樣品植物總RNA，經核酸測定儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度和純度后，-80 ℃保存備用。

表1 RT-qPCR及GlIPT1基因克隆所用的引物序列

1.3.4 cDNA合成

用于熒光定量PCR 的cDNA 合成方法參照參考TAKARA 公司的SYBR? Premic Ex TaqTM（Tli RnaseH Plus）說明書進行操作。

1.3.5 熒光定量PCR

根據轉錄組數據通過注釋信息篩選獲得5 條基因，利用Primer Premier 5.0 軟件設計引物（見表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以珊瑚菜內源Actin為內參基因，以1.3.4 合成的cDNA 為模板，構建體系后置于熒光定量PCR 儀中反應（采用三步法程序）：第一步，95℃，10 min；第二步，95℃，15 s；54℃，30 s；72℃，30 s；40 cycles 第三步，95℃，15 s；60℃，1 min；95℃，1 s。將篩選得到的表達量上調的基因以珊瑚菜根、葉、花cDNA 為模板，按上述條件進行組織特異性分析[24]。

1.3.6 RACE克隆

根據轉錄組數據分析發現獲得的候選基因序列已有5′端，故對其進行3′RACE 克隆，特異性引物3′RACE Long、3′RACE Short，見表1。參照SMARTer?RACE 5′/3′Kit User Manual 方法進行反轉錄，生成第1鏈cDNA。反應體系參照SMARTer?RACE 5′/3′Kit User Manual，利用Touchdown PCR 程序擴增3′末端序列：第1步，94℃，30 s；72℃，1 min；5個循環；第2步，94℃，30 s；70℃，30 s；72℃，1 min；5個循環；第3 步，94℃，30 s；68℃，30 s；72℃，1 min；25個循環。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用TIAN Midi Purification Kit瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒回收目的條帶。回收產物與pMD18-T 載體16 ℃連接16 h 后轉化DH5α感受態細胞，在含有氨芐的LB 固體培養基平板上進行培養，長出單菌落，菌液PCR初步驗證后選取3個陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.7 全長cDNA克隆

本研究使用DNAMAN 軟件將轉錄組中已知序列片段和測序得到的序列片段進行拼接，得到全長序列，根據所得序列在NCBI 上進行同源蛋白比對后將其命名為GlIPT1。利用Primer Premier 5.0軟件設計引物（見表1），進行全長cDNA 克隆。以珊瑚菜葉cDNA為模板，參照TaKaRa rTaq 酶說明書配制體系，進行PCR 程序：95℃，5min；95℃，30 s；52℃，30 s；72℃，1min；72℃，5min；4℃，終止反應。

1.3.8 生物信息學分析

本研究使用NCBI 的ORF Finder 和Conserved Domains 在線網站分別進行開放閱讀框（ORF）和保守結構域分析；使用ExPASy 的Protparam、ProtScale 進行蛋白質理化性質及親疏水性預測；使用TMHMM Server在線網站預測蛋白質跨膜區；使用SOMPA在線網站進行蛋白二級結構分析；使用SWISS-MODEL 在線網站構建三維模型并用PyMOL 軟件對其進行分析；最后，使用ClustalX及MEGA6.0軟件構建NJ系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 珊瑚菜無菌苗制備結果

在超凈工作臺中，將珊瑚菜種子完整的胚輕輕剝離，置于MS 固體培養基上培養。珊瑚菜幼胚遠離培養基的一面細胞生長速度加快，使得胚的子葉部位和根原基部位接觸MS 培養基表面，其余部位懸空，大約2 d左右形成了一個明顯的“拱橋”結構，部分胚的胚軸部位變紫色。此后，胚的根部開始急劇延伸，根冠深深地鉆入MS 培養基的深處，子葉體積變大，胚軸部位日漸增長，到第6 d 可以看出幼苗的雛形。在第15 d左右珊瑚菜幼苗在MS 培養基上發育成一株完整的幼苗，兩片子葉中央已經伸出了第一片真葉，根已由白色徹底變為深紫色，且具備大量叢生須根（見圖2-A）。

圖2 珊瑚菜無菌苗培養及GlIPT1基因表達量分析

2.2 熒光定量PCR結果分析

茉莉酸甲酯處理后經過熒光定量PCR，從5 條GlIPT 候選基因中篩選得到一條表達量上調的基因c94067_g1，基因表達量結果見圖2-B。由圖中可以看出，在茉莉酸甲酯處理后，該基因表達量上調2.5 倍。進一步分析了在根、葉、花中的表達量（見圖2-C），結果顯示該基因在花中的表達量最高，其次是根中，而葉中的表達量最低。

2.3 北沙參GlIPT1基因的RACE擴增和序列分析

利用已知GlIPT1序列設計特異性引物，制備北沙參RACE 模板，進行touch down 程序，克隆得到GlIPT1基因3′末端序列為228 bp（見圖3-A）。將測序結果與已知序列拼接，獲得1296 bp 目的基因的cDNA 序列。將該蛋白序列與NCBI 上植物的同源序列進行比對，結果表明GlIPT1與近源物種胡蘿卜Daucus carotasubsp. sativus（XP_017225932.1）的IPT 蛋白序列相似性為89%，確定克隆得到的為北沙參IPT 基因的全長cDNA 序列，將其命名為GlIPT1。利用NCBI ORF Finder 進行開放閱讀框分析得到該序列長1296 bp，ORF（Open Reading Frame）921 bp，5′ UTR 200bp，3′UTR 147 bp，polyA 尾長28 bp，編碼306個氨基酸，編碼的蛋白質相對分子質量為34409.30Da（見圖3-B）。

2.4 生物信息學分析

2.4.1 同源性分析及結構域預測

圖3 GlIPT1基因3′RACE PCR擴增結果及全長cDNA序列

對北沙參GlIPT1基因編碼蛋白質與NCBI 上植物的同源序列進行比對。結果表明，GlIPT1 與胡蘿卜Daucus carotasubsp. sativus（XP_017225932.1）、萵 苣Lactuca sativa（XP_023756099.1）、刺 苞 菜 薊Cynara cardunculus（XP_024995249.1）、向日 葵Helianthus annuus（XP_022015460.1）的蛋白序列相似性分別為89%、61%、62%、60%。對GlIPT 蛋白保守結構域進行分析，結果表明GlIPT屬于P-loop_NTPase superfamily。IPT基因在胡蘿卜、擬南芥、向日葵、刺苞菜薊、萵苣等不同物種中，其閱讀框長度在980～1200 bp 左右，基因長度在不同物種中相對保守。

圖4 GlIPT1蛋白質親疏水性預測

2.4.2 蛋白理化性質分析

使用ExPASy 的Protparam 在線工具對IPT1 蛋白氨基酸序列進行分析，結果表明IPT1 蛋白有306個氨基酸，相對分子質量為34409.30 Da，等電點為5.93。使用ExPASy 的Protscale 在線工具預測IPT 蛋白親疏水性（見圖4），IPT 蛋白在第261個氨基酸位點，最低峰值是-2.433，在第28個氨基酸位點，最高峰值是2.611，總平均親水性為-0.289。使用TMHMM Server v.2.0 在線工具對IPT 蛋白氨基酸序列進行分析，結果表明該蛋白沒有跨膜結構域。

2.4.3 蛋白二維、三維結構預測

采用在線軟件SOPMA 預測GlIPT1 蛋白的二級結構（見圖5-A），發現GlIPT1蛋白二級結構中α-螺旋占50.33%、延伸鏈占9.80%、β-轉角占6.86%、無規卷曲占33.01%。IPT 主要結構為α-螺旋和無規卷曲，已知α-螺旋是最為穩定的蛋白質空間結構，GlIPT1蛋白中α-螺旋的比例在50%左右，因此，推測該蛋白比較穩定。通過在線軟件SWISS-MODEL 對GlIPT1 蛋白進行三維模型構建（見圖5-B）。GlIPT1 以3a8t.1.A 蛋白作為模體，相似性為55.99%，三維結構均包括10個β-折疊、13個α-螺旋。

圖5 GlIPT1蛋白的二級、三級結構預測

圖6 GlIPT1蛋白的NJ系統進化樹

2.4.4 系統進化分析

將GlIPT1cDNA 編碼的306個氨基酸序列與GenBank 中常見物種的同源基因氨基酸序列比較，發現北沙參GlIPT1所編碼的氨基酸與其他物種的IPT基因編碼的氨基酸序列的同源性較高。利用MEGA 6.0軟件構建NJ 系統進化樹，由圖6 可以看出，GlIPT1 與傘形科植物胡蘿卜Daucus carotasubsp.sativus的異戊烯基轉移酶親緣關系最近，與其他物種的IPT 蛋白親緣關系較遠，符合進化關系。

3 討論

北沙參為我國傳統中藥材，功效顯著，藥用價值高，市場需求旺盛，是亟待研究的典型代表。北沙參種子中胚壞死比例較高，萌發率很低，僅為12%[25]。在無菌苗制備時，如直接采用北沙參種子在培養基上萌發，效率很低；胚乳部分還可能殘留微生物，難以消毒徹底，染菌率高。本實驗采用了一種北沙參無菌苗制備的新方法，以北沙參種子中剝離的胚為培養對象獲得無菌苗，克服了傳統無菌苗培養的技術缺陷。通過本方法生產的北沙參無菌苗的成活概率接近100%，染菌率低。

本實驗基于已構建的珊瑚菜根和葉的比較轉錄組文庫，重點關注香豆素合成途徑差異表達基因，通過注釋信息初步篩選了5 條IPT 候選基因。進一步用茉莉酸甲酯處理材料，在5 條候選基因中篩選得到1條表達量上調的基因。根據篩選出的GlIPT1轉錄組已有部分序列，利用RACE技術克隆該基因，獲得相應的全長cDNA。通過與同科植物胡蘿卜的IPT 同源蛋白序列BLAST 進行比對，相似度達89%，與其他物種的同源蛋白序列相似度也較高；其他生物信息學分析也顯示：北沙參IPT基因與同科近緣物種胡蘿卜的IPT具有緊密的系統進化關系，且GlIPT 的保守結構域、蛋白結構等均與胡蘿卜的IPT相似。從而證明本研究獲得了北沙參GlIPT1的cDNA基因序列。

目前，異戊烯基轉移酶作為細胞分裂素合成途徑的限速酶的相關研究已較為深入，在木薯、黃瓜等植物中也已克隆到IPT 基因[26-27]，并分析了其在乙烯、茉莉酸甲酯等逆境信號下的表達模式[28]，但是作為次生代謝途徑中的關鍵酶研究較少，僅在少數藥用植物中克隆到異戊烯基轉移酶同源基因。有研究顯示，植物細胞次生代謝產物積累和植物細胞的分化和組織化程度正相關[29]，如四翅月見草根的組織化和分化有利于根里面次生代謝產物的積累[30]。紅豆杉細胞分化程度與紫杉醇等次生代謝物的生產密切相關[31]。在加入甲基茉莉酮酸誘導紫杉醇積累的過程中，IPT 酶的活性大大提高[32]。東北紅豆杉IPT 的表達和紫杉醇積累也呈正相關[20]。劉玉函等[24]研究發現，總香豆素類物質在珊瑚菜的果實中積累量明顯高于根與葉，在根中的表達量又高于葉中的表達量，這與本研究分析的GlIPT1基因在不同器官的表達量變化趨勢較為一致。本研究中，通過實時熒光定量PCR 分析香豆素合成關鍵酶GlIPT1在珊瑚菜不同器官中的表達量存在差異，顯示該基因在花中表達量最高、在根中表達量明顯高于葉中的表達量。初步證明GlIPT1為參與香豆素次生代謝途徑的關鍵酶基因，該基因的表達與香豆素的積累可能存在直接關系。

總之，本研究篩選并克隆了北沙參GlIPT1cDNA全長，為闡明北沙參香豆素類關鍵酶異戊烯基轉移酶（IPT）對香豆素合成作用的分子機制及揭示北沙參香豆素類次生代謝途徑奠定基礎。將有利于提高北沙參香豆素合成關鍵酶的效率，從而提高北沙參香豆素及其他次生代謝產物的產率和產量，并為進一步驗證關鍵酶IPT基因的體內功能奠定基礎，同時也對未來通過生物技術手段調控北沙參香豆素含量提供可能，最終獲得高產植株做好準備。此外，GlIPT家族基因成員可能不止一個，其相互關系及具體功能有待進一步開展。