藤莓湯改善CIA模型大鼠關節滑膜免疫炎性損傷的機制研究＊

楊 蕾，張正菊，相瑞陽，顧 文，張紅紅，何毓璽，王達利，劉 慧，馬衛國，孟鳳仙

（1. 北京中醫藥大學東方醫院風濕科 北京 100078；2. 北京中醫醫院風濕科 北京 100010；3. 順義中醫院風濕科 北京 101300）

類風濕關節炎（Rheumatoid arthritis，RA）是由T、B細胞介導的全身性自身免疫病，以慢性滑膜炎癥為主要病理特征[1]。RA 主要以滑膜為靶組織，病理可見滑膜充血水腫，滑膜細胞增生，血管周圍可見滑膜增生，肉芽組織增生和血管翳形成，關節軟骨破壞，纖維樣關節強直[2]，最終導致嚴重畸形、關節功能喪失。流行病學研究發現，全世界患病率約1%，我國患病率約0.3%，本病好發年齡為40-50歲，且女性患病率是男性的3 倍[3]。西醫治療RA 主要以緩解癥狀、控制病情為主，以非甾體抗炎藥、改善病情抗風濕藥、糖皮質激素類藥物等為主要用藥，這些藥物雖能暫時緩解癥狀，但長期安全性并不明確。近年來，白芍總苷、雷公藤等在治療RA 中療效確切，中醫藥能夠通過多靶點、多途徑、多環節治療RA。因此，探究中藥對RA 的作用機制具有重要應用價值。

免疫炎性損傷貫穿著RA 發病的始終，由于機體免疫穩態被打破，關節滑膜免疫系統被激活，大量的淋巴細胞浸潤，引起了關節腔內環境穩態失衡，加速關節局部免疫-炎性的惡循環。本課題組前期研究發現，藤莓湯（Tengmei Decoction，TMD）能夠有效緩解膠原誘導性（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠關節腫脹情況，改善關節炎大鼠關節炎指數評分，能夠抑制大鼠關節滑膜組織中炎性分子的表達，緩解模型大鼠關節滑膜局部炎性損傷。經研究發現，關節炎局部突變型P53（Mutant P53，mt-p53）既能夠抑制成纖維細胞的凋亡、促進細胞增殖[14]，又能夠通過激活NF-kB 途徑，參與細胞外基質降解及關節軟骨破壞[15]。增殖誘導配體（a proliferation-inducing ligand，APRIL）則能夠通過與相應受體結合，直接/間接促進T、B 細胞的形成、增殖，參與關節滑膜局部炎癥反應及免疫調節[17]。因此，本實驗通過觀察TMD 對CIA 模型大鼠APRIL、mt-P53、IL-2表達水平的影響，探討其改善RA 模型大鼠關節滑膜免疫炎性病理損傷的分子機制是否與調控滑膜局部mt-P53 信號途徑，抑制炎性細胞浸潤，改善滑膜組織過度增殖有關。

1 材料與方法

1.1 動物

實驗所需要的動物為：SPF 級雄性SD 大鼠40 只，體重210±10 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2012－0001。其中6 只為正常組，剩余均為造模組，飼養環境：溫度21℃-22℃，相對濕度60%-70%，自由飲食，適應性喂養1周。

1.2 藥物

實驗所需要的藥物為：藤莓湯[6]（忍冬藤30 g、蛇莓15 g、烏梢蛇10 g、沒藥10 g、桑枝15 g、穿山龍15 g 等）濃煎成50 mL，由北京中醫藥大學東方醫院藥劑科提供；來氟米特片（10 mg，蘇州長征－欣凱制藥有限公司，批號：130126）。

1.3 試劑與儀器

實驗所需要的試劑與儀器為：牛Ⅱ型膠原（美國Chondrex，批號：130087），完全弗氏佐劑（美國Sigma公司，批號：CAS9007-81-2），Anti-P53 antibody（英國Abcam 公司，批號：ab131442），IL-2 ELISA 試劑盒（美國eBioscience 公司，批號：87728012），Beta-Actin 抗體（英國Abcam 公司，批號：ab6276），GAPDH、目標上下游引物為(上海)英駿公司合成。

定量PCR 儀（美國ABI 公司），DYY-10C 電泳儀（北京六一儀器廠），5810R 臺式冷凍離心機（德國Eppendorf 公司），JY-2Y1 轉膜儀（北京君意東方公司），UV-2000 紫外分光光度計（上海尼柯公司），RT-6000型酶標儀（深圳雷杜公司）。

1.4 模型制備、分組及干預方法

根據造模方法[5-6]取牛CⅡ乳劑于大鼠尾根部皮內注射，0.2 ml/只，記錄當天為初次免疫，9 天后，每只大鼠尾根部皮內注射0.1 ml乳化劑，作為加強免疫，正常組兩次分別注射0.2 ml、0.1 ml生理鹽水，免疫16 d時，根據關節炎指數評分（arthritisindex，AI），進行模型成功評判，具體判定標準參照文獻[7]，AI 評分≥4 分視為造模成功。本次實驗成模率為83.33%。

采用隨機數字表法選取成模大鼠24只參與后續實驗研究，中藥給藥組每組6只分為TMD高劑量組（High dose of TMD group，HTMD）、TMD 低劑量組（Low dose of TMD group，L TMD），以TMD 生藥量31.8、15.9 g/(kg·d-1)灌胃；模型組（Model group，MG）、陽性對照組（Positive drug group，PDG）每組6只分別予去離子水10 mL/(kg·d-1)、來氟米特1.87 mg/(kg-1·d-1)灌胃；另設正常對照組（Normal group，NG），6 只，予去離子水10 mL/(kg·d-1)，各組連續干預12 周。陽性對照藥組及TMD 高、低劑量組藥量相當于臨床常人用藥劑量5.6、11.2、5.6倍。

1.5 檢測指標及方法

干預結束后，10%水合氯醛麻醉后，腹主動脈取血、離心、提血清，用于ELISA 檢測；大鼠死亡后，將其置于冰面，取右踝關節，置于4%固定液中，以備病理學觀察。取雙膝關節滑膜，迅速放入凍存管中，置于液氮中保存以備Real-time PCR、Western Blot 技術檢測。

1.5.1 大鼠關節滑膜組織mt-P53、APRIL、IL-2基因轉錄水平檢測

檢測取大鼠膝關節滑膜組織標本，使用TR Izol試劑提取RNA 后，進行一步法Real-time PCR 反應。反應體積為25 μL，反應體系含樣本RNA 2 μL，POWER SYBR GREEN 17.2 μL，10 pmol 引物各0.8 μL。反應條件為：42℃滅活5 min，95℃變性10 s，95℃退火5 s，60℃延伸34 s，共40個循環。結束后終止循環，計算三個重復均值并記錄。使用Sequence Detection System軟件分析PCR 過程各檢測樣本的Ct 值。引物設計及合成情況見表1。以β-actin 作為內參基因，采用相對定量方法，根據以下公式計算各基因的起始模板濃度。起始模板相對表達量=2-ΔΔCt

表1 引物設計及合成情況

1.5.2 大鼠關節滑膜組織中mt-P53 蛋白表達水平檢測

取大鼠膝關節滑膜組織30 mg，預冷RIPA蛋白抽提試劑，取1 ml RIPA加入樣品中，混合添加蛋白抑制劑，混勻后充分震蕩以助于裂解，待混合液體，清透為止。置于冰塊上孵育20 min，孵育后，離心4℃，13000 rpm離心20 min，吸取上清，測定蛋白濃度，煮沸變性5 min，-20℃保存。配制12%分離膠，5%濃縮膠，加定量后蛋白樣本，跑電泳。濕法電轉移至PVDF膜。將PVDF膜放入封閉袋中，加入含5%脫脂奶粉封閉液TBST，搖床搖動2 h。按照1∶1000孵育一抗，4℃過夜。次日，用封閉液稀釋孵育二抗（1∶5000），稀釋過后將其與膜共同孵育2 h。孵育結束，將ECL 小心滴加到膜的蛋白上，反應180 s；將膠片曝光時長控制在10 s-5 min范圍（注：曝光時間隨不同光強度而調整），先顯影2 min，之后再定影，詳細流程參照[5]。

采用凝膠圖像分析系統對Western Blot 蛋白雜交條帶進行掃描，并用gel-pro 軟件對圖像進行灰度分析。相對含量的變化=目的蛋白灰度/actin灰度。

1.5.3 大鼠血清中IL-2蛋白表達水平檢測

大鼠經腹主動脈取血后，放入15 ml 離心管中，常溫靜置2 h，離心（4℃，3000 rmp，15 min），采用ELISA技術檢測大鼠血清中IL-2細胞因子的表達水平，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行具體實驗操作。

1.6 統計學方法

采用SPSS 20.0 統計軟件進行分析，數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時，各組間兩兩比較采用LSD 檢驗，方差不齊時，則采用Tamhance'sT2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各實驗組大鼠關節滑膜組織中APRIL mRNA 轉錄水平比較

與正常組比較，模型組大鼠關節滑膜組織中APRIL mRNA 轉錄水平上調（P＜0.01）。與模型組比較，各治療組關節滑膜組織中APRIL mRNA 轉錄水平下調（P＜0.01）（見表2，圖1）。

表2 各組大鼠關節滑膜組織中APRIL mRNA轉錄水平x±s，cpm

圖1 各組大鼠滑膜組織中APRIL mRNA轉錄水平

2.2 各組大鼠關節滑膜組織中mt-P53mRNA 轉錄及蛋白表達水平比較

與正常組比較，模型組關節滑膜組織中mt-P53mRNA及蛋白表達水平上調（P＜0.01）。與模型組比較，各治療組關節滑膜組織中mt-P53mRNA 及蛋白表達水平下調（P＜0.01）（見表3，圖2-圖4）。

2.3 各組大鼠關節滑膜、血清中IL-2mRNA 轉錄水平及蛋白表達水平比較

與正常組比較，模型組滑膜組織、血清中IL-2 mRNA 及蛋白表達水平均上調（P＜0.01，P＜0.05）。與模型組比較，各治療組IL-2 mRNA 及蛋白表達水平均水平下調（P＜0.01，P＜0.05）（見表4，圖5、圖6）。

表3 各組大鼠關節滑膜組織中mt-P53mRNA轉錄及蛋白表達水平±s

表3 各組大鼠關節滑膜組織中mt-P53mRNA轉錄及蛋白表達水平±s

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.05。

組別正常對照組模型組陽性對照組藤莓湯高劑量組藤莓湯低劑量組N 6 6 6 6 6 mt-P53 mRNA 91.74±9.92326.98±12.37##151.03±11.02**193.25±11.62**262.91±11.88**蛋白12.13±1.0921.70±2.05##14.76±0.93**16.43±0.66**18.04±0.91**

表4 各組大鼠關節滑膜、血清中IL-2mRNA轉錄水平及蛋白表達水平±s

表4 各組大鼠關節滑膜、血清中IL-2mRNA轉錄水平及蛋白表達水平±s

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.05。

組別蛋白35.78±13.2454±10.63##32±10.11**44.86±12.63*59.8±18.67**正常對照組模型組陽性對照組藤莓湯高劑量組藤莓湯低劑量組N 6 6 6 6 6 IL-2 mRNA 92.01±6.73199.78±10.81##110.04±12.95**145.86±10.20**147.56±6.86**

圖2 各組大鼠滑膜組織中mt-p53 mRNA轉錄水平

圖3 各組大鼠血清中mt-p53蛋白表達水平

圖4 各組大鼠血清中mt-p53蛋白表達水平

圖5 各組大鼠滑膜組織中IL-2 mRNA轉錄水平

圖6 各組大鼠血清中IL-12蛋白表達水平

3 討論

RA 在中醫屬“痹病”范疇，傳統中醫認為，本病的發生發展是由于人體正氣不足、衛外不固，風寒濕熱等外邪乘虛而入，留置經脈關節，引起關節、筋骨疼痛、腫脹。古代醫家對本病病因的認識包括內因、外因兩個方面。內因主要是正氣不足，正氣不足是導致RA 發病的決定性內在作用，機體正氣不足，則外來風寒濕熱之邪乘虛侵襲經絡、關節、肌肉、四肢等。《黃帝內經》云：“正氣存內，邪不可干”“邪之所湊，其氣必虛”，因此“正虛”才是本病發展的核心環節。外因包括飲酒當風，冒雨涉水，或久居濕地等，則寒濕、濕熱等外邪乘虛入侵，壅滯經絡、關節，導致疾病發生。故感受外邪是類風濕關節炎發生的重要環節。邪盛正虛，內外因合，發為此病。

近代醫家對痰濁、瘀血互結致病頗為重視。宋代醫家陳無擇在《敘痹論》中提到：“榮衛不清，氣血敗濁，凝結而成”。清代喻昌《醫門法律》曰：“風寒濕三痹之邪，每借人胸中之痰為相援”。故痰濁留竄骨節經絡，閉阻氣血，凝而為痹。清代王清任在《醫林改錯》中也有“瘀血致痹”說。痰濁和瘀血既是機體在病邪作用下的病理產物，又是機體進一步病變的因素。本病日久，痰濁和瘀血互結，以致病情纏綿難愈，出現關節腫大變形僵硬，皮下結節，肢體麻木，病處固定而拒按，日輕夜重，局部腫脹或有硬結，口干不欲飲，舌質紫黯或有瘀斑，舌下靜脈迂曲延長，脈細澀等證。

RA 顯著地病理變化為滑膜增生：滑膜層增多，由正常的3～5 層增厚到10～20 層且以襯里層細胞異常增生最為明顯[2]，成纖維樣滑膜細胞是其主要的增殖細胞，同時也是滑膜組織中促炎性細胞因子及基質降解酶的主要來源，其具有自主增生、無錨定生長、缺乏接觸抑制和表達原癌基因等腫瘤細胞的生長特點。經研究發現，RA 關節滑膜中成纖維細胞過度增殖與p53 基因突變有關[12]。p53 是一種腫瘤抑制基因，在人體存在兩種表達形式：野生型（wild type p53，wt-p53）與mt-p53。wt-p53 可以急速機體受損的DNA 或異常增殖的癌基因細胞凋亡。mt-p53 蛋白是wt-p53 基因發生突變后表達的蛋白，因分子構象發生變化而半衰期延長，mt-p53 不僅失去了促細胞凋亡等能力，還可干擾wt-p53 基因的功能[13]。而在RA患者關節滑膜中發現wt-p53 功能喪失。在AA 大鼠模型中，mt-P53 通過調控細胞周期，影響FLS 的凋亡[14]。mt-P53 通過NF-KB 途徑，介導MMP-9 表達，參與細胞外基質降解及關節軟骨破壞[15]。APRIL 是腫瘤壞死因子配體家族成員，主要由單核細胞、巨噬細胞、B 細胞、T 細胞產生。APRIL通過與相應受體結合，促進腫瘤的形成、增殖及存活，同時參與機體的炎癥反應及免疫調節等[16]。在RA患者的血清中出現高表達的APRIL。APRIL刺激RA 患者通過FLS 產生白細胞介素-1β（Lnterleukin1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor，TNFα）、以及IL-6，加速局部炎癥反應。同時異常增殖的FLS 能夠分泌APRIL，進一步通過刺激信號加速T 細胞活化，形成正反饋[17]。此外，RA 患者滑膜中的FLS產生APRIL，并與其受體結合，通過自分泌和旁分泌的形式，促進FLS 增殖，通過細胞網絡的相互作用，加速T 細胞活化，形成正反饋[18]。IL-2 是一種活化并維持T 細胞分化和增殖的生長因子，參與炎癥和自身免疫性反應[19]。研究發現，RA 患者血清中IL-2、TNF-a及白細胞介素-13（Lnterleukin13，IL-13）均明顯升高，且與RA 疾病活動度密切相關[20]。中藥能夠降低CIA模型大鼠血清中IL-2、TNF-a 及IL-1 表達水平，改善大鼠關節腫脹度[21]。

本課題組前期研究發現，TMD 能夠改善通過激活PPARr/NF-ΚB 途徑，抑制IL-6、TNF-α等炎性因子表達[5]，還能夠激活TRAF3，抑制NF-ΚB 入核，改善CIA大鼠免疫炎性損傷[6]。因此，TMD 改善CIA 模型大鼠關節炎癥反應是明確的，結合當前研究熱點，我們設計了本次實驗，目的是探究TMD 是否能夠抑制關節滑膜過度增殖，減少關節局部滑膜免疫炎性細胞過度聚集，進而改善關節炎大鼠關節局部免疫炎性反應？本研究發現，CIA 模型大鼠滑膜組織中mt-P53、APRIL、IL-2mRNA 轉錄水平及mt-P53、IL-2mRNA 蛋白表達水平明顯高于正常組，提示mt-P53、APRIL 參與關節滑膜免疫炎性損傷，與相關文獻報道一致。經TMD 干預后，各劑量組APRIL mRNA 轉錄水平，IL-2、mt-P53mRNA 轉錄水平及蛋白表達水平顯著下調，表明TMD 能夠抑制mt-P53、IL-2、APRIL 表達水平。因此，我們認為TMD 能夠降低大鼠關節滑膜、血清中mt-P53、IL-2、APRIL 表達水平，改善關節炎模型大鼠關節滑膜免疫炎性損傷，可能與TMD 抑制關節滑膜過度增殖，降低炎癥因子的表達有關。相關研究將進一步進行。