基于仿生識別系統對金銀花顏色與“氣”的鑒別研究＊

姚月保，楊曉蕓，彭 蓮，俞越童，邵遠洋，鄒慧琴，閆永紅

（1. 北京中醫藥大學中藥學院 北京 102488；2. 昆藥集團股份有限公司研究院 昆明 650106；3. 中山大學附屬第三醫院藥劑科 廣州 510630）

金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花[1]，有悠久的藥用歷史，有清熱解毒，疏散風熱的功效[2]，常用于治療喉痹，丹毒[3]。現代研究表明，金銀花具有提高免疫力、解熱、抗炎等功效[3]。

每種中藥材都有自己特定的顏色、氣味，和其所含的化學成分相關，在長期用藥實踐中，一直把顏色和氣味作為評價中藥材質量的重要標準之一[1]。對上等藥材的性狀鑒別中，常常包括顏色和氣味的語言描述，例如金銀花以表面綠色[4-6]，香氣濃者為佳。藥材的顏色、氣味不僅由它的品種和產地決定，不正確的加工、儲存方法也會使藥材性狀特征發生改變，失去原有的色澤和氣味。因此，在傳統經驗鑒別的指導下，我們可通過藥材性狀特征，辨別出藥材的品種、產地、加工方法、儲藏時間和質量優劣等。然而，由于在傳統的性狀鑒別中，人們只是憑借視覺和嗅覺對藥材的顏色、氣味特征進行評定，鑒定的主觀性強，使得傳統經驗鑒別中顏色和氣味特征難以客觀、準確地評價藥材的質量。

隨著現代仿生技術的不斷發展及其與中藥鑒定學科的交叉結合，色度儀、電子鼻仿生技術被迅速地運用于中藥品質評價，使中藥顏色、氣味的表述不再是主觀性、抽象化的定性描述，而是數字化、客觀化的定量描述。色度儀是基于三濾色片原理，利用儀器內部的標準光源照明樣本，樣本選擇性吸收反射光線，光電探測器檢測反射光并與標準光源作比較、計算[7]。電子鼻又稱仿生嗅覺系統、氣味掃描儀，它是以特定的傳感器和模式識別系統快速提供被測樣品的整體氣味信息,指示樣品的隱含特征[8]，因此，能夠反映中藥材的“整體氣味特征”，符合傳統中醫藥“整體觀”的理論思想，而且不需要對樣品進行前處理，可對樣品進行無損分析。

藥材所含化學成分種類及含量高低與藥材的顏色、氣味密切相關，通過顏色、“氣”的客觀量化可以有效地評價中藥的質量。何婉婉等[9]通過對北豆根顏色和化學成分的相關性分析，發現粉末的顏色橙紅色越深，其所含的生物堿含量越多。鄒慧琴等[10]引入分光測色計，確定了甘草去皮打粉的斷面顏色量化方法和以直接測量為主、濕法施壓剝皮測量為輔的表皮顏色量化方法，測量方法簡便、可靠，測量結果顯示可以如實反映藥材顏色情況，為中藥顏色數字化發展提供了新思路。拱健婷等[11]選取易走油中藥苦杏仁為研究載體，通過色度儀、電子鼻量化樣品走油前后的顏色、氣味變化，為中藥貯藏過程中以顏色、“氣”的客觀量化來評價中藥質量提供新的思路與參考。黃學思等[12]通過色彩色差計和電子鼻分別對檳榔樣品（生檳榔、炒檳榔、焦檳榔）的顏色、“氣”進行客觀量化，判別中藥炮制的“火候”，以此來評價檳榔炮制品。

為了實現對中藥顏色、“氣”描述的客觀化、規范化，本文將仿生系統技術——色度儀和電子鼻引入中藥性狀鑒別，以常用大宗藥材金銀花為研究對象，建立金銀花顏色、“氣”數字化分析方法，為快速、準確評價金銀花質量提供依據，同時利用化學計量學方法建模分析以實現對不同儲藏期、產地及處理方式金銀花的快速鑒別。

1 材料儀器

1.1 材料

5 批金銀花樣品收集于河南、河北和山東三個主產區（河南A、河南B、河南C、河北、山東），所有樣品經北京中醫藥大學中藥資源與鑒定系閆永紅教授鑒定，確定為藥典所規定的忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.

藥材的顏色、氣味和其品種、產地密切相關，同時長時間的儲藏、高溫烘烤、日照等也會使藥材的顏色、氣味發生變化。藥材儲藏過久，其內部會發生氧化、酶催化等反應，高溫會加速藥材內部細胞活動或使細胞死亡，藥材在光照下易發生氧化和分解等活動，這些均會導致藥材顏色和氣味發生改變[13]。因此，為得到不同顏色和氣味的金銀花樣品進行研究，本實驗對上述收集的5 批樣品分別按如下方法處理：①河南A、河北、山東進行常溫避光儲藏，每兩個月進行一次測量；②河南B 分別進行70℃烘箱加熱、日光光照處理，當顏色或氣味發生改變時測量；③河南C 進行日光光照處理，當顏色或氣味發生改變時測量。烘箱加熱的溫度太低，顏色改變較慢，溫度太高會將樣品烤糊，因此將烘箱加熱的溫度定為70℃；日光光照為從8:00—17:00日光照射，溫度為外界氣溫平均溫度。

樣品信息見表1。

表1 金銀花樣品信息

1.2 儀器

BP211D 型1/100 電子分析天平（德國賽多利斯），帶有積分球及色度分析軟件的U-3010 紫外可見分光光度計（日本日立公司），粉碎機（北京興時利和科技發展有限公司），自制石英測色皿，α-Fox3000 電子鼻指紋分析儀（法國AlphaMos公司），藥典篩。

2 方法

圖1 CIE1976L*a*b*均勻色空間系統

2.1 性狀鑒別

組建測評小組對所有金銀花樣品分別做顏色、“氣”感官評價，測評小組由10位有鑒定專業知識背景的北京中醫藥大學資源與鑒定專業的在讀研究生組成，感官評價前對測評小組成員進行一段時間的相關培訓。

傳統認為金銀花表面綠色[4-6]，香氣濃者為佳，所以將感官評價指標顏色由深到淺的文字描述定為：綠色-黃綠色-綠白色-黃白色-黃色，同一個顏色深淺分4個不同等級，“1”為最深，“4”為最淺，如“綠色1、綠色2、綠色3、綠色4”是將綠色分為了4個不同等級，“1”為最深，“4”為最淺；氣味由濃到淡的文字描述定為：濃郁香氣-氣清香-氣微。同一個氣味濃淡分4個不同等級，“1”為最濃，“4”為最淡，如“濃郁香氣1、濃郁香氣2、濃郁香氣3、濃郁香氣4“是將濃郁香氣分為了4個不同等級，“1”為最濃，“4”為最淡。

2.2 數字化顏色的測定

本試驗采用目前使用較廣泛的CIE1976L*a*b*均勻色空間系統[14]，如圖1 所示，L*表示明度，值越大越偏白，反之偏黑；正負a*分別表示紅綠方向；正負b*分別表示黃藍方向；ΔE*ab = {(ΔL*)2+(Δa*)2+ (Δb*)2}1/2表示色差，通常認為其≤1時，人眼無法分辨兩種顏色的差異。

2.2.1 供試品的制備

粉碎金銀花樣品，過4號篩。混合均勻過篩粉末，以把測色皿裝滿為標準，取適量的粉末裝入石英測色皿中，蓋上石英玻璃片，并用自封膜封口，備用。

2.2.2 色度測量條件

針對工作需要的不同，顏色測量儀器分為分光測色計和色彩色差計，生產中的色差測量常使用色彩色差計，而分光測色計因為精度比較高，常用于高精度色彩的分析，其中日立3010紫外可見分光光度計精度更高，更適合科研研究，且較適宜測量粉末類樣品。因此，本實驗選擇日立3010紫外可見分光光度計作為顏色測量儀器。

起止波長：780-380 nm；掃描速度：600 nm·min-1；狹縫寬度：1 mm；照明光源：D65；視場選擇：10 度視角。

2.2.3 色度測量方法

將標準白板分別放入日立3010 紫外可見分光光度計中積分球的參比處、樣品處，按照2.2.2項下所設定的條件進行基線校正，當基線校正后取出放置于樣品處的標準白板，將2.2.1中所制得的供試品放入積分球的樣品處，進行測量。

2.2.4 精密度考察

選取河北的樣品，按照2.2.1 方法制備樣品，連續測量6 次，結果顯示RSD 均＜3%，說明儀器精密度良好。

2.2.5 重現性考察

選取河北樣品6 份，按照2.2.1 方法制備樣品，分別進行測量，結果顯示RSD 均＜3%，說明方法重現性良好。

2.3 數字化氣味的測定

2.3.1 供試品的制備

粉碎金銀花樣品，使其通過2 號篩，混合均勻粉末。稱取0.5 g 樣品粉末，裝入頂空瓶，并立刻壓蓋密封。

2.3.2 頂空樣品制備條件

孵化時間：360 s，孵化時間：45℃，樣品震蕩速度：250 r·s-1。

2.3.3 分析條件

進樣量2500 μL，注射速度2500 s，載氣為空氣，流速150 mL·min-1，數據采集時間120 s，數據采集周期1 s，數據采集延遲300 s，吹掃時間480 s。

3 結果與分析

3.1 性狀鑒別結果

組建測評小組對金銀花樣品分別作顏色、“氣”感官評價，建立感官描述表，見表2。

將金銀花樣品按不同顏色、氣味歸類,結果見表3。傳統性狀鑒別金銀花以顏色發綠、濃郁香氣者質量為佳，黃色、氣微類質量較差，從性狀描述的結果來看，在避光儲藏、加熱和光照的樣品中，隨著儲藏時間的推移，樣品的顏色逐漸變淺，氣味逐漸變淡。光照樣品中溫度越高，顏色和氣味變化越明顯。

表2 金銀花樣品感官描述表

3.2 顏色數字化測量結果

按照2.2 所述對所有金銀花樣品進行顏色測量，每個樣品重復3次，記錄平均值，結果見表4。

表4 金銀花顏色測量指標值

對金銀花所測得的數據進行分析發現，在不同產地金銀花方面，購入的河南、河北和山東產金銀花在顏色上有明顯差異，河南產的金銀花較其他兩個產地的金銀花相比a*值更小，說明其顏色較其他兩種偏綠；河北產的金銀花b*值大于其他兩個產地，說明其顏色較偏黃；山東產的金銀花L*大于其他兩地的金銀花，說明其明度更高，顏色更淺。傳統鑒別經驗認為金銀花偏綠色者為佳[4-6]，從顏色測量值可以推出，河南產的金銀花質量優于其他兩地，這與傳統鑒別經驗一致[15]。

樣品1-5（未做處理的金銀花）的L*值小于經過常溫避光、加熱、光照儲藏的部分樣品，說明經過常溫避光、加熱、光照儲藏后，部分金銀花的顏色逐漸變白；樣品1-5（未做處理的金銀花）的a*值為負值，則說明其顏色偏綠，這些樣品經過常溫避光、加熱、光照儲藏后，部分樣品的a*值逐漸增大為正值，說明其顏色中綠色的成分逐漸減少；樣品2、3 在經過加熱和光照儲藏后，顯示其b*逐漸減少，說明其顏色中黃色成分逐漸減少。綜上，經過常溫避光、加熱、光照儲藏后，金銀花的L*、a*值逐漸增大，b*值逐漸減小，說明顏色逐漸變淺。

采用色度儀對金銀花顏色進行分析后，將顏色測定值和性狀鑒定結果相結合，對金銀花的五類顏色劃定大致范圍，見表5。通過對每類顏色的L*、a*、b*值的范圍劃定，使我們對金銀花顏色的描述由主觀的視覺判斷和感性描述變為定量的客觀的描述。

表5 金銀花五類顏色的L*、a*、b*值范圍表

將表4 數據以EXCEL 文件保存,然后輸入到SIMCA-P + 13.0 軟件（Umetrics，Sweden）進行分析。數據采用OPLS-DA 分析，分析過程中根據3.1 性狀鑒別結果項下表3 將樣品按照顏色不同分為5 類，結果見圖2。

圖2 不同顏色金銀花的L*、a*、b*OPLS分析

從表5 和圖2 可以看出部分范圍區間有交叉重合現象，這是由目測顏色分類不準確引起的，說明傳統性狀鑒別對顏色的主觀性描述難以客觀、準確地評價藥材的質量。傳統感官評價很大程度上依賴于操作者的經驗判斷，有著很強的經驗性和主觀性，例如對藥材顏色的描述黃白色、黃色等詞語，這種模糊語言的描述，相互之間并沒有明確的界限，可能對于同一種中藥，不同的人觀察后做出的判斷可能不太相同，即使經驗豐富的中藥鑒定人員也不易分辨清楚，而且人的感覺器官容易疲勞。

表6 不同產地及處理方式金銀花樣品分組

3.3 氣味測量結果分析

用電子鼻分別對41份樣品按2.3實驗條件進行測試，每份樣品重復3 次。釆集了12 根傳感器響應值數據，將電子鼻測量結果建立判別因子分析判別模型。

3.3.1 不同產地及處理方式金銀花樣品判別模型的建立

將樣品按不同產地及處理方式分組，分組情況見表6。

利用每份樣品的每根傳感器最大響應值進行DFA分析，分析結果見圖3。

如圖所示，判別因子1 和判別因子2 和大于85%，說明樣品區分度很大，DFA 判別模型能夠較好的區分不同組別的金銀花。儲藏樣品組1、2、3 和樣品組4、8均是常溫狀態下放置、未經過加熱和光照處理的樣品，判別結果將其聚為了一類。判別結果將樣品組5、7、9 聚為了一類，這幾組樣品均是經過光照處理后的樣品。樣品組6 單獨聚成了一組，其特點是經過加熱處理后的樣品。所有樣品均經過確認，識別值均為100%。說明不同的金銀花在“氣”（揮發性成分的種類和含量）上有一定的區別，并且DFA 模型能夠很好的區分氣味濃郁和氣微的金銀花。

圖3 不同產地及處理方式金銀花樣品的DFA判別模型

表7 金銀花不同儲藏期分組

3.3.2 不同儲藏期判別模型的建立

將樣品按不同儲藏期分組，分組情況見表7。

將表7的數據進行判別分析，分析結果見圖4。

圖4 不同儲藏期金銀花樣品的DFA判別模型

如圖所示，判別因子1 和判別因子2 和大于85%，說明DFA 判別模型能夠將不同儲藏期的金銀花進行較好的分類。判別結果將分組1 單獨聚為了一類；分組2、3 聚為了一類；分組4 聚為了一類；分組5、6、7、8聚為了一類。未經過儲藏樣品、短期儲藏樣品和長期儲藏樣品在電子鼻結果分析上有很好的區分，所有樣品均經過確認，識別值均為100%，表明存儲時間不同的金銀花在“氣”（揮發性氣體的種類和含量）上有著一定的區別，并且DFA 模型能夠很好的區分氣味濃郁和氣微的金銀花。

4 討論

本課題組將仿生識別儀器——色度計與電子鼻引入中藥品質評價中，對顏色、“氣”進行客觀測定，同時對各指標成分進行含量測定，將代表顏色、“氣”的指標值與代表質量指標值相聯系，探索顏色、“氣”與有效成分之間的相關性，揭示了傳統性狀鑒別經驗的合理性，將老藥工傳承下來的鑒別經驗數字化，并且可通過對顏色、“氣”的測量，快速地判斷或預測藥材有效成分含量，完善中藥品質的評價模式，推進中藥現代化。課題組前期已對金銀花顏色、“氣味”與其所含化學成分的相關性進行研究，發現在一定程度上，金銀花顏色測量值L*越小，所含的綠原酸含量越低；多酚類、葉綠素含量與顏色值關系規律不明顯。金銀花“氣”綜合指標值與綠原酸、多酚類含量有顯著性正相關關系；與木犀草苷之間不存在顯著相關關系，證明金銀花的顏色、“氣”與其內在的化學成分密切相關，并已發表文章[45-48]。本文則側重于為傳統中藥性狀鑒別中感官顏色與“氣”的客觀化、數字化分析方法的建立提供參考，用于指導實踐。