補腎壯督方對大鼠退變髓核組織中miR-155-5p及凋亡相關蛋白的影響＊

周文明，林一峰，張 震，白榮飛

（1. 廣州中醫藥大學 廣州 510000；2. 廣州中醫藥大學附屬骨傷科醫院 廣州 510240；3. 深圳市沙井人民醫院 深圳 518104；4. 廣東省中醫院 廣州 510030）

椎間盤退行性病變（intervertebral disc degeneration，IDD）是造成腰腿痛的重要原因之一[1]。研究表明，過度的細胞凋亡引起的髓核細胞減少在椎間盤退變中起著關鍵作用[2]。Gruber 等[3]研究發現，在術中取出的退變和衰老的椎間盤，其細胞凋亡率為53%-73%。在髓核細胞凋亡中，線粒體凋亡通路發揮著重要作用[4]。近年來，miRNA 與髓核細胞凋亡之間的關系受到關注，其中有文獻報道miR-155 參與了髓核細胞凋亡的調控[5-6]。

補腎壯督方是林一峰教授通過長期臨床所得的經驗方，主要由鹿角膠、海馬、黃芪、熟地黃、細辛所組成。適用于椎間盤退行性變所導致的頸椎病、腰椎間盤突出、椎管狹窄癥等疾病。在臨床應用中，補腎壯督方對于改善患者局部疼痛、酸麻脹痛等神經癥狀效果明顯[7]。

本研究通過建立大鼠椎間盤退變模型，分組給予補腎壯督方干預后，觀察miR-155-5p 及Bax、Bcl-2、Cytc 及active Caspase-3 表達差異，探討髓核細胞凋亡與以上表達差異之間的關系，以及補腎壯督方治療椎間盤退變的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8 周齡SPF 級雄性SD 大鼠100 只，購于廣州中醫藥大學實驗動物中心（實驗動物質量合格證號：SCXK（粵）2013-0034），體重350 ± 50 g。在標準條件下進行適應性飼養7天。

1.2 中藥制備

補腎壯督方配方組成如下：鹿角膠10 g、海馬5 g、黃芪30 g、熟地黃20 g、細辛4 g。（以上中藥由廣州中醫藥大學第三附屬醫院中藥房提供）

按上述比例將飲片制成粗粉（除鹿角膠外），按上述比例將中藥混合后，加6 倍量水后浸泡30 min，武火煮沸后再文火30 min取汁；藥渣再加5倍水量，同前法煎煮，將以上兩次煎煮好的藥液均勻混合，以濾網濾除藥渣，將鹿角膠烊化后溶入藥液中，后用旋轉蒸發儀濃縮至1.8 g·mL-1，常溫冷卻后，置于冰箱中保存備用。

1.3 主要試劑

水合氯醛購自國藥集團化學試劑有限公司（批號：20170305）；Tunel 試劑盒試劑盒購自羅氏制藥有限公司（批號：A0306）；Anti-Bax 抗體（批號：J3216）、Anti-Bcl-2抗體（批號：D1638）、Anti-Active Caspase-3抗體（批號：K1005），Anti-Cytochrome C（批號：G0311）抗體購自艾博抗（上海）貿易有限公司；Primers（批號：DH1203）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；HRP 羊抗鼠（批號：108623）、HRP 羊抗兔購自武漢博士德生物公司(批號：230164)；BeyoECL Plus 購自上海碧云天生物技術有限公司（批號：KJ3511）；TRE-Trizol（批號：15596-026）購自賽默飛（中國）有限公司；Allin-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit（批 號：AOMD-Q050）購 自美國GeneCopoeia 公司；miRcTte miRNA Isolation Kit（批號：DP501）購自天根生化有限公司；SYBR Premix Ex Taq II（批號：GH3059）購自寶日生物技術有限公司。

1.4 主要儀器

恒溫搖床（上海博迅公司）；熒光倒置顯微鏡（德國徠卡公司）；激光掃描共聚焦顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）；臺式高速離心機（中科中佳公司）；半干轉膜儀、電泳儀及凝膠成像系統（上海天能公司）；Real Time PCR 儀及凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司）；高速冷凍離心機（德國SIGMA公司）。

1.5 造模分組及中藥灌胃

按體重分層后，采用隨機數字表法將100 只大鼠分為五組，分別為空白對照組、模型組、低劑量中藥組、中劑量中藥組和高劑量中藥組，每組20 只。10%水合氯醛腹腔麻醉，空白對照組僅暴露椎間盤（未穿刺椎間盤）。除空白對照組外，其他組均參照崔立揚等椎間盤穿刺造模法造模[8]。術后給予8 萬單位青霉素肌注，0.2 mL/只，連續用藥3天。造模成功后，對高、中、低劑量組大鼠分別予以中藥灌胃，灌胃前將藥液置于溫水中恢復常溫后，按高、中、低劑量組分別給予1 mL、2 mL、4 mL 藥液，上下午各灌胃1 次?？瞻讓φ战M和模型組則分別予等量生理鹽水灌胃。

表1 引物名稱、序列及產物長度

1.6 標本采集

按上述方法中藥灌胃4 周后，每組隨機抽出10 只大鼠，腹腔注射麻醉脫頸處死后，通過原切口進入，截取L3/L4、L4/L5 腰椎及其間的椎間盤組織，生理鹽水清洗除去血液，剔除纖維環，保留髓核組織，4%中性多聚甲醛溶液固定，制作石蠟切片；部分髓核組織置凍存管內，于液氮中保存備用。

1.7 觀察指標

1.7.1 髓核細胞凋亡率

采用TUNEL 法檢測髓核細胞凋亡率。髓核組織石蠟切片按常規方法脫蠟至水，PBS清洗，加入蛋白酶K 工作液反應后，再加50 μL TUNEL 反應混合液標本上，蓋玻片在暗濕盒中反應37℃×1 h。PBS洗5 min×3，玻片上浸入2μg·mL-1DAPI 染液，DAPI 復染后，加滴熒光封片液。熒光顯微鏡下，每個樣品隨機計數5個視野，計算細胞凋亡指數=凋亡細胞數/總細胞數×100%，取其平均值作為最終髓核細胞凋亡指數。

1.7.2 qRT-PCR檢測

通過實時定量PCR 技術檢測miR-155-5p 及Bax、Bcl-2、Cytc mRNA 的表達。按照試劑盒說明，完成樣品前處理及總RNA、miRNA 的提取，cDNA 合成及miRNA 反轉錄。根據目的基因的種屬（大鼠），在NCBI 數據庫查詢參考核苷酸序列，采用Primer 3.0 設計引物，引物序列無非特異性擴增，應用于實驗。反應體系的配制，反應參數參考試劑盒說明進行；該試驗擴增曲線和融解曲線應用Bio-Rad CFX96 RT-PCR System 的操作方法進行。運用Bio-Rad CFX96 RTPCR 儀 配 套 的Bio-Rad CFX Manager Software1.6 數據分析軟件進行分析，且采用2^-ΔΔCt法來計算。

圖1 補腎壯督方對大鼠髓核細胞凋亡影響（原位末端轉移酶標記染色，×400）

1.7.3 蛋白質印跡法（Western Blot）檢測

采用蛋白質印跡法測定active Caspase-3、Bcl-2、Cytc 及Bax 表達量。采用蛋白質印跡法(Western Blot)檢測。從髓核組織中提取總蛋白，使用考馬斯亮藍G250檢測蛋白質溶液的OD值，調整樣品的蛋白濃度，完成蛋白定量。隨后依次進行電泳、轉膜、封閉、孵育一抗；加入按說明書稀釋好的一抗，4℃過夜。孵育后TBST洗滌5 min×3。孵育二抗：按說明書對二抗進行稀釋，室溫輕搖孵育1 h，孵育完畢TBST 洗滌5 min ×3。在暗室將雜交后印跡膜放入顯色盒中，加上顯色液，經ECL化學發光，X光片壓片，顯影、定影、洗片，獲取目的條帶圖像，以GAPDH為內參。

1.7.4 統計學處理

2 結果

2.1 各組凋亡率水平

與空白對照組相比，模型組髓核細胞凋亡指數顯著增高（P＜0.05）。補腎壯督方灌胃干預后，高、中、低劑量中藥組髓核細胞凋亡指數較模型組均顯著降低（P＜0.05）。高、中、低劑量中藥組相互比較，中、高劑量組凋亡指數較低劑量組顯著降低（P＜0.05），中、高劑量組之間雖有差異，但無統計學意義。下圖1 中紅色熒光的細胞核為TUNEL 陽性結果，藍色為DAPI復染的細胞核，與空白對照組相比，髓核細胞凋亡明顯增加，從26%增加至65%；與模型組相比，低、中、高劑量組髓核細胞凋亡均有不同程度減少，從41%減少至23%。如下表2、圖1所示。

表2 各組大鼠椎間盤髓核細胞凋亡指數

2.2 qRT-PCR檢測結果

2.2.1 各組大鼠miR-155-5p表達水平比較

與空白對照組相比，模型組miR-155-5p 表達量顯著減少（P＜0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量組髓核組織中miR-155-5p 表達量顯著增加（P＜0.05）；中、高劑量組較低劑量組顯著增加（P＜0.05），中、高劑量組之間雖有差異，但無統計學意義。如下表3所示。

表3 各組大鼠髓核細胞miR-155-5p表達量

2.2.2 各組大鼠Bcl-2、Cytc 及Bax 在mRNA 上表達水平比較

（1）與空白對照組相比，模型組Bax 及Cytc 在mRNA 水平上表達量顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量組椎間盤組織中Bax 及Cytc 在mRNA 水平上表達量顯著減少（P＜0.05）。（2）與空白組相比，模型組Bcl-2 在mRNA 水平上表達量顯著減少（P＜0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量組在mRNA 水平上表達量上Bcl-2 明顯增加（P＜0.05）；見下表4。

表4 各組大鼠髓核組織Bcl-2、Cytc及Bax mRNA表達量

2.3 Western blot檢測結果

與空白組相比，模型組active Caspase-3、Bax 及Cytc 表達量顯著增加（P＜0.05），Bax/Bcl-2 比值顯著增加（P＜0.05），而Bcl-2 表達量顯著減少（P＜0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量組椎間盤組織中active Caspase-3、Bax 及Cytc 顯著減少（P＜0.05），Bax/Bcl-2比值增加（P＜0.05）顯著減少，而模型組Bcl-2 表達量顯著增加（P＜0.05）；active Caspase-3、Bax 及Cytc 在高劑量組較低、中劑量組顯著減少（P＜0.05），低、中劑量組之間雖有差異，但無統計學意義；Bcl-2 在高劑量組較低、中劑量組顯著增加（P＜0.05），低、中劑量組之間雖有差異，但無統計學意義；Bax/Bcl-2 比值增加（P＜0.05）在低、中、高三個劑量組間均有顯著差異（P＜0.05）。見下表5，表6及圖2。

表5 各組大鼠髓核組織active Caspase-3及Cytc蛋白表達量

表6 各組大鼠髓核組織Bcl-2、Bax蛋白表達量及Bax/Bcl-2比值

圖2 大鼠Active caspase-3、Bcl-2、Bax及Cytc蛋白表達量

3 討論

椎間盤是一種由纖維和軟骨所構成的結構，其主要作用是在椎體間傳導壓力和吸收震蕩。由于其內無血管分布，僅僅依靠組織間的彌散作用來供給營養，加上脊柱負重等因素，從而導致其極易發生退化[9]。在椎間盤退變過程中，由細胞凋亡所介導的髓核細胞減少起到關鍵性作用[2]。隨著髓核細胞的大量凋亡，其所合成的蛋白多糖及Ⅱ型膠原減少，使得髓核作為“壓力吸收器”的功能大大減弱，進而導致了椎間盤退變的發生。本實驗中通過TUNEL 法檢測大鼠退變椎間盤髓核組織中髓核細胞凋亡情況，發現大鼠模型組椎間盤組織內髓核細胞凋亡指數較空白對照組顯著增加，中藥灌胃后檢測發現髓核細胞凋亡指數較模型組不同程度顯著減少，這一發現表明在椎間盤退變過程中髓核細胞凋亡發揮了重要作用，補腎壯督方對于抑制髓核細胞凋亡，改善椎間盤退變有顯著作用。

miRNA 廣泛存在于病毒和真核生物體內，在生物體生長、發育、繁殖和疾病發生等過程中發揮著重要作用[10]。miRNA 在調節蛋白表達過程中通過互補或不完全互補的方式與基因mRNA 相應區域靶向結合，可沉默或抑制靶基因的表達[11]。李濤等[12]通過人結腸癌細胞體外培養及qRT-PCR 檢測發現miR-155 較癌旁組織升高，抑制miR-155 表達后，細胞凋亡率增高，線粒體凋亡通路相關蛋白Bcl-2 及Cytc 同時增高。Wang 等[13]研究發現在人髓核細胞中miR-155 可靶向調控FADD 及active Caspase-3，抑制miR-155表達時，FADD 及active Caspase-3 則過表達，導致髓核細胞凋亡。active Caspase-3 是miR-155 的靶蛋白，通過上調miR-155 可導致active Caspase-3 下調，而下調miR-155 則引起active Caspase-3 過表達。本實驗通過qRT-PCR 檢測顯示，miR-155-5p 模型組表達量較空白對照組顯著降低，補腎壯督方灌胃后其表達量較模型組顯著增高。這表明miR-155-5p 可能參與髓核細胞凋亡的線粒體凋亡通路，并在退變的髓核組織中呈低表達。

在哺乳動物中，線粒體是調節大部分凋亡通路的主要細胞器，其細胞凋亡的調控中心。研究表明，線粒體凋亡通路在髓核細胞凋亡中發揮著重要作用[13]。細胞內部損傷或在應激條件下，上游信號分子作用于線粒體膜，Bcl-2 蛋白家族活化形成蛋白孔道，線粒體PT 孔開放，凋亡活性物質（如Cytc 等）釋放，引起下游Caspase-9 活化，并進一步激活active Caspase-3，促使細胞發生不可逆的凋亡。Bcl-2 蛋白家族可以調控線粒體膜通道的開放以及凋亡相關物質的流動，是線粒體凋亡通路中關鍵分子[4]。其家族成員按照功能可以分為兩大類：抑制凋亡家族成員（如Bcl-2）以及促進凋亡家族成員（如Bax）。其中Bcl-2 能穩定線粒體膜功能阻止其釋放Cytc及Caspase 家族蛋白，而Bax可促進線粒體跨膜電位下降，引起Cytc 的釋放，進而引發凋亡[15-16]。Bax/Bcl-2 比值預示著細胞走向凋亡或存活，其比值有增高趨勢則細胞趨向凋亡，下降趨勢則趨向存活；本實驗研究發現，在基因表達方面，Cytc mRNA、Active Caspase-3 mRNA、Bax mRNA 表達模型組較空白對照組顯著增加（P＜0.05），Bcl-2 mRNA 則顯著減少（P＜0.05）；補腎壯督方灌胃干預后，Cytc mRNA、Active Caspase-3 mRNA、Bax mRNA 表達中藥組（低、中、高）較模型組顯著減少（P＜0.05），Bcl-2 mRNA 則顯著增加。在蛋白表達方面，Cytc、active Caspase-3、Bax 蛋白表達模型組較空白對照組顯著增加（P＜0.05），Bcl-2 則顯著減少（P＜0.05），Bax/Bcl-2比值顯著增加（P＜0.05）；中藥干預后，Cytc、active Caspase-3、Bax 蛋白表達中藥組（低、中、高）較模型組顯著減少（P＜0.05），Bcl-2 則顯著增加（P＜0.05），Bax/Bcl-2 比值顯著減?。≒＜0.05）；由此我們推測線粒體通路所導致的髓核細胞凋亡參與了椎間盤退變過程，補腎壯督方可減少髓核細胞凋亡進而改善椎間盤退變。

中醫中雖無“椎間盤退行性變”一說，但是根據其臨床表現，將其歸屬于“痹癥”范疇。本課題組在長期臨床中，總結經驗認為其病機總屬“督脈氣衰、陽氣不振”，并擬補腎壯督方以“溫養督脈”為治則，方中以鹿角膠及海馬為君藥，以補腎壯督，通陽化氣；黃芪、熟地為臣藥，以滋陰合陽，補氣行血；佐以細辛，以通絡化痰，行氣止痛[7,17]。在前期實驗過程中發現該方可提高椎間盤退變大鼠椎間盤ATP 酶活性，保護線粒體的生理功能，延緩大鼠腰椎間盤退變[18]。

綜上所述，椎間盤退變大鼠造模成功后經補腎壯督方干預，髓核細胞凋亡率顯著減少，Active Caspase-3、Cytc 和Bax mRNA 及蛋白表達均明顯下降，而miR-155-5p、Bcl-2 mRNA 及蛋白表達明顯增加，由此推斷補腎壯督方的機制可能通過減少Active Caspase-3、Cytc 和Bax 表達，增加Bcl-2 蛋白表達，抑制線粒體通路所導致的髓核細胞凋亡，從而改善椎間盤退行性變。miR-155與線粒體凋亡通路之間的關系尚需進一步研究以闡明。