花生致敏蛋白Ara h 1雙抗體夾心ELISA法的建立

王 耀 陳 曦 武漢良 衛 星張國慶 張淑霞 劉勝男

(1. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2. 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九八九醫院檢驗科，河南 洛陽 471031；3. 三門峽市檢驗檢疫中心，河南 三門峽 472000；4. 鄭州海關技術中心，河南 鄭州 450002;5. 三門峽海關，河南 三門峽 472000；)

近年來，食物過敏患病率日趨上升[1-2]，由于目前仍缺乏致敏閾值研究以及過敏癥狀有效治療方法研究，食物過敏患者只能通過藥物緩解過敏癥狀，并避免接觸致敏食物以保護自身[3]。因此，許多國家已通過制定法規或標準，強制要求在食品標簽中標識致敏物質[4]。中國食品安全國家標準審評委員會在2018年底公布的《預包裝食品標簽通則》(GB 7718)修訂草案征求意見稿中也已將致敏物質標示作為預包裝食品標簽標示的基本內容。花生是八大常見致敏食物之一[5]，也是諸多食品標簽標準中要求標示的主要致敏成分。花生含有多種致敏蛋白，其中Ara h 1是主要致敏蛋白之一，能被大部分的過敏患者血清識別[6]。Ara h 1約占花生蛋白總量的12%～16%，也是花生中含量最多的致敏蛋白[7]，其三聚體具有很強的穩定性，胃腸道的消化作用和加熱均難以破壞其致敏性[8]。因此，為了更好地保障過敏消費者的食品安全，研究食品中花生致敏物質的靈敏、特異、高效檢測方法尤為必要。目前，用于花生致敏物質檢測的方法主要包括聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)[9-10]、酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[11-12]和質譜法(Mass spectrometry，MS)[13-14]，其中PCR和ELISA是實驗室、食品企業及監管機構篩查食品致敏成分最常用的快速定性和定量分析方法[15]。PCR是基于致敏蛋白標志性基因的檢測方法，不能直接反映是否含有致敏物質[16]，而ELISA是基于蛋白質的檢測方法，可利用抗體針對性的檢測致敏蛋白。現有用于花生致敏物質檢測的ELISA法常基于多抗建立，而利用多抗進行檢測時存在特異性不足的問題[17]。試驗擬利用所制備的Ara h 1鼠源單抗提高致敏蛋白捕獲特異性，再通過Ara h 1兔源多抗進行夾心檢測，建立花生致敏蛋白Ara h 1的雙抗體夾心ELISA法并對其檢測特性進行鑒定，以期為食品中花生致敏蛋白的快速篩查提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑溶液

花生致敏蛋白Ara h 1和Ara h 2：美國INDOOR公司；

大豆球蛋白、卵清蛋白、酪蛋白、牛血清蛋白4種常見致敏蛋白，3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(Tetramethyl benzidine，TMB)：美國Sigma-Aldrich公司；

HRP標記的山羊抗兔IgG抗體(GaRIgG-HRP)：索萊寶生物科技公司；

其他試劑均為市售分析級；

Ara h 1兔源多抗(Polyclonal antibody，pAb)、Ara h 1 鼠源單抗(Monoclonal antibody，mAb)及超純水：實驗室制備；

ELISA包被液(0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，CBS)、稀釋液(0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，PBS)、洗滌液(含0.05% Tween-20的PBS，PBST)、封閉液(含5%脫脂奶的PBST溶液)、顯色液(TMB緩沖液)、終止液(2 mol/L H2SO4)等溶液：實驗室配置。

1.2 主要儀器

電子天平：BSA224S型，德國Sartorius公司；

酶標儀：Multiskan FC型，美國Thermo Scientific公司；

振蕩器：Vortex2型，艾卡(廣州)儀器設備有限公司；

控溫磁力攪拌器：SZCL-2型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

恒溫培養箱：HPX-9052MBE型，上海博迅實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 pAb與mAb的制備 pAb為Ara h 1免疫新西蘭白兔，經純化血清制備，其效價達2.56×105以上；mAb為Ara h 1免疫BLAB/c小鼠，通過細胞融合篩選陽性雜交瘤細胞株，經體外誘生腹水法制備[18]，其效價達5.12×105以上，親和常數Ka為2.65×108L/mol，親和力較高且具有良好的特異性。

1.3.2 雙抗體夾心ELISA步驟 將Ara h 1 鼠源mAb作為捕獲抗體包被酶標板，首先用CBS稀釋mAb，100 μL/孔加入酶標板，在4 ℃條件下過夜包被，用PBST洗板4次后拍干，再向酶標板加入封閉液200 μL/孔，在37 ℃條件下封閉1 h，洗板(同上)后備用。

檢測時首先將樣液100 μL/孔加入酶標板，并設置陰性孔(PBS 100 μL/孔加入)，在37 ℃條件下孵育1 h后洗板；將Ara h 1 兔源pAb作為檢測抗體，用封閉液稀釋pAb，100 μL/孔加入酶標板，在37 ℃條件下孵育30 min后洗板；用封閉液1∶5 000倍稀釋GaRIgG-HRP，100 μL/孔加入酶標板，在37 ℃條件下孵育30 min后洗板；顯色液100 μL/孔加入酶標板，室溫反應顯色10 min；最后加入終止液100 μL/孔終止反應，用酶標儀讀取OD450nm值。

1.3.3 捕獲抗體和檢測抗體工作濃度的優化 采用棋盤法優化抗體工作濃度[19]。將mAb用CBS稀釋為1∶5 000，1∶7 500，1∶10 000，1∶12 500的稀釋度，每個稀釋度100 μL/孔包被酶標板兩行；第1行加入100 μL/孔確定濃度的Ara h 1標準溶液，第2行加入100 μL/孔PBS作為陰性對照；孵育、洗板后，將pAb用封閉液稀釋為1∶2 000，1∶4 000，1∶6 000，1∶8 000的稀釋度，每個稀釋度100 μL/孔加入酶標板3列；孵育、洗板后，加入封閉液稀釋的GaRIgG-HRP進行孵育，然后顯色、終止，并測定OD450 nm值。當所測定的OD450 nm值(P)和陰性對照OD450 nm值(N)的比值(P/N)最大時，其所對應的捕獲抗體mAb和檢測抗體pAb的稀釋度分別作為最優工作濃度。

1.3.4 雙抗體夾心ELISA法的特性鑒定

(1) 靈敏度：通過檢測限(Limit of detection，LOD)的確定以鑒定方法的靈敏度。用PBS配制不同濃度的Ara h 1 標準溶液，利用優化抗體工作濃度的雙抗體夾心ELISA法進行檢測。以標準溶液濃度的對數值為橫坐標，以各標準溶液檢測所得OD450 nm值為縱坐標，繪制雙抗體夾心ELISA法的標準曲線。然后將空白樣品進行20次重復測定，根據標準曲線回歸方程得到對應濃度，計算重復測定結果的平均值(X)和標準差(SD)，以X+3SD作為檢測限[20]。

(2) 特異性：通過交叉反應試驗鑒定檢測方法的特異性[21]。利用雙抗體夾心ELISA法分別檢測高濃度的其他致敏蛋白(花生致敏蛋白Ara h 2、大豆球蛋白、卵清蛋白、酪蛋白、牛血清蛋白)。若測定OD450 nm值(P)和陰性對照OD450 nm值(N)的比值P/N<2.1，則說明方法與其他致敏蛋白無交叉反應，特異性良好。

(3) 準確度：通過添加回收試驗鑒定方法的準確度[22]。在5%脫脂奶中添加Ara h 1，分別配制成10，100，200 ng/mL添加濃度的樣品，每個濃度的添加樣品利用雙抗體夾心ELISA法重復檢測6次，通過計算每個添加濃度樣品的平均回收率以及變異系數(CV)以鑒定方法的準確度。

(4) 穩定性：在4 ℃條件下避光密封保存已包被捕獲抗體的酶標板，利用雙抗體夾心ELISA法分別在保存前和保存的第30，60，90天檢測同一濃度Ara h 1標準溶液，通過對比不同保存時間測定同一濃度溶液的P/N值的差異，以鑒定方法的穩定性[23]。

2 結果與分析

2.1 捕獲抗體和檢測抗體最佳工作濃度

用PBS配制100 ng/mL的Ara h 1標準溶液，利用已包被不同稀釋度mAb的酶標板進行棋盤試驗，通過不同稀釋度的pAb對Ara h 1標準溶液及陰性對照進行檢測，得到不同抗體稀釋度下的各孔OD450 nm值。結果如表1 所示，當捕獲抗體mAb以1∶10 000的稀釋度包被ELISA板，檢測抗體pAb以1∶8 000的稀釋度作為工作濃度時，計算所得P/N值最大，所以捕獲抗體mAb和檢測抗體pAb最佳工作濃度分別為1∶10 000和1∶8 000稀釋。

表1 捕獲抗體和檢測抗體最佳工作濃度的優化

2.2 靈敏度鑒定

配制濃度分別為2，4，8，16，32，64，128，256，512 ng/mL的Ara h 1標準溶液，經雙抗體夾心ELISA法檢測后，以各標準溶液濃度的對數值為橫坐標，以檢測所得OD450 nm值為縱坐標，繪制標準曲線如圖1所示，標準曲線的線性范圍為4～256 ng/mL，線性回歸方程為y=1.145 7x-0.587 5，R2=0.991 1。重復測定空白樣品20次，將測定所得OD450 nm值代入線性回歸方程求得測定濃度，計算平均值(X)+3×標準差(SD)，得到方法檢測限為4.16 ng/mL，表明所建立的雙抗體夾心ELISA法具有良好的靈敏度。

圖1 雙抗體夾心ELISA法標準曲線

2.3 特異性鑒定

利用雙抗體夾心ELISA法分別檢測濃度為500 ng/mL的花生致敏蛋白Ara h 2、大豆球蛋白、卵清蛋白、酪蛋白和牛血清蛋白。所得測定OD450 nm值(P)和陰性對照OD450 nm值(N)結果如表2所示，P/N值均<2.1，表明雙抗體夾心ELISA法與其他常見致敏蛋白無交叉反應。由于方法建立所使用的捕獲抗體為特異性良好的鼠源mAb，因此能夠對單一致敏蛋白識別捕獲，使檢測方法顯示出良好的特異性。

表2 雙抗體夾心ELISA法特異性鑒定結果

2.4 準確度鑒定

將Ara h 1添加至5%脫脂奶中，分別配制成10，100，200 ng/mL 3個添加濃度的樣品，通過利用雙抗體夾心ELISA法重復檢測6次，計算每個添加濃度樣品的平均回收率及CV，結果如表3所示，平均回收率為85.9%～94.5%，CV為6.1%～8.7%，表明檢測方法具有較高的準確度。

表3 雙抗體夾心ELISA法準確度鑒定結果

2.5 穩定性鑒定

將已包被捕獲抗體的酶標板在4 ℃條件下避光密封保存，分別在保存的不同時間利用雙抗體夾心ELISA法檢測100 ng/mL的Ara h 1標準溶液，結果如表4所示，不同保存時間測定所得的P/N值均無明顯變化，說明4 ℃ 避光密封保存條件下，酶標板至少可穩定保存90 d，表明方法的穩定性良好。

表4 雙抗體夾心ELISA法穩定性鑒定結果

3 結論

試驗依據雙抗體夾心檢測原理，利用Ara h 1 鼠源mAb作為捕獲抗體，Ara h 1 兔源pAb作為檢測抗體，通過棋盤法優化抗體工作濃度，建立Ara h 1的雙抗體夾心ELISA法。通過對方法檢測特性進行鑒定，其檢測限為4.16 ng/mL，具有較高的靈敏度；交叉反應試驗表明與其他致敏蛋白無交叉，特異性強；添加回收試驗平均回收率為85.9%～94.5%，具有較高的準確度；且在4 ℃條件下避光密封保存90 d內檢測結果穩定；能夠對快速靈敏、準確特異的對花生致敏蛋白Ara h 1進行檢測。與已有的一些基于多抗研制的商品化ELISA試劑盒相比[24]，試驗方法通過mAb提高對于單一致敏蛋白的高親和力特異性捕獲能力，再以pAb作為夾心檢測抗體，進一步增強對致敏蛋白的高效識別，在檢測特異性和靈敏度上表現出了一定優勢。能夠用于食品標簽中致敏物質標示信息的快速篩查，提升花生過敏患者的飲食安全性。