mTOR抑制劑PP242對高糖誘導足細胞損傷保護機制的實驗研究

邵金金，劉新艷

糖尿病腎病是糖尿病的慢性微血管并發癥之一，蛋白尿是糖尿病腎病的主要臨床表現，若病情持續進展，最終發展為慢性腎衰竭。腎小球濾過屏障受損是蛋白尿產生的主要因素，而足細胞是腎小球濾過屏障的重要組成部分，足細胞結構和功能的完整性與蛋白尿的產生關系密切。高糖引起的足細胞損傷包括足細胞肥大、足細胞凋亡等。有研究表明，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制劑(如雷帕霉素)對高糖引起的足細胞損傷可能具有保護作用[1]。本研究觀察高糖誘導的小鼠腎足細胞增殖與凋亡、裂孔隔膜分子Podocin表達的變化以及新一代mTOR抑制劑PP242的干預作用，探討PP242對高糖誘導足細胞損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 RPMI1640培養基購自Hyclone公司，PP242 購自美國Cayman公司，小鼠γ-干擾素購于賽業生物，兔抗小鼠Podocin多克隆抗體、小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體購于美國Abcam公司，辣根過氧化物酶標記二抗購于中杉金橋生物公司，胎牛血清購于四季青公司。四甲基偶氮唑藍(MTT)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑購于碧云天生物技術公司。PP242用二甲基亞砜(DMSO)溶解后，配制成100 mmol/L的儲存液，過濾以后進行分裝，分裝好的PP242凍存。

1.2 足細胞培養及傳代 小鼠腎足細胞購于北納生物。足細胞首先培養于含10%胎牛血清、50 U/mL小鼠γ-干擾素的1640培養液中，置于33 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養箱中培養，當細胞生長至70%～80%融合度時，用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(含0.05%胰蛋白酶及0.02%EDTA)消化傳代，然后轉入不含γ-干擾素但含10%胎牛血清的1640培養液中，置于37 ℃、5%CO2培養箱中繼續培養，誘導分化7～14 d后進行實驗。

1.3 實驗分組 將足細胞分為4組。正常組給予葡萄糖5.5 mmol/L；高糖組給予葡萄糖30 mmol/L；PP242干預1組給予葡萄糖30 mmol/L、1 μmol/L PP242； PP242干預2組給予葡萄糖30 mmol/L、10 μmol/L PP242。

1.4 MTT法檢測足細胞增殖 取分化培養好的足細胞，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養液調整細胞濃度，調至4×104/mL，然后接種在96孔培養板，每孔200 μL細胞懸液；放置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h，細胞貼壁生長呈亞融合狀態后，更換為無血清的1640培養基，繼續培養24 h，使細胞進入靜止期G0期。按照分組情況，分別給予不同的干預，繼續培養48 h；于培養結束前4 h，每孔加入MTT液(5 mg/mL)20 μL，繼續培養4 h；棄掉細胞培養液，每孔加入DMSO 150 μL，于室溫下振蕩5 min，然后靜置10 min。將酶標儀調至490 nm處，測定樣本吸光度A值(OD490)。實驗結果重復3次。

1.5 流式細胞儀檢測足細胞凋亡 取分化培養好的足細胞，用RPMI 1640培養液調整細胞濃度至3×105/mL，然后接種于6孔培養板，每孔2 mL細胞懸液。37 ℃、5%CO2培養箱培養24 h，細胞貼壁生長呈亞融合狀態后，更換為無血清1640培養基，繼續培養24 h，使細胞進入G0期。按照分組情況，給予不同的干預后，繼續培養48 h。用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌貼壁細胞1次，消化細胞，收集培養細胞，1 000 g離心5 min，棄上清，PBS重懸細胞并計數，取1×106重懸的細胞，1 000 g離心5 min，棄上清，加入195 μL的細胞結合液，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL 的碘化丙錠溶液，混勻后于室溫避光孵育15 min。采用流式細胞儀分析。

1.6 Western Blot檢測Podocin蛋白的表達 首先提取蛋白，培養并分組處理足細胞方法同1.5，收集標本。用預冷的PBS洗滌足細胞2次，加入細胞裂解液，然后冰上裂解30 min，4 ℃離心，15 000 r/min離心10 min，吸取上清液。用BCA法測定蛋白濃度。將變性后的蛋白樣品加樣，每孔30 μg，先電泳分離，后轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，室溫下，以5%脫脂奶粉進行封閉，用1∶200稀釋的Podocin多克隆抗體，1∶1 000稀釋GAPDH單克隆抗體，4 ℃孵育，過夜。用辣根過氧化物酶標記的二抗，繼續孵育1 h，ECL化學發光法進行顯影、定影。用SAGECREATION凝膠成像系統成像，用Lane 1D分析軟件對特異性條帶進行灰度掃描，以Podocin蛋白條帶與GAPDH蛋白條帶的灰度比值表示Podocin蛋白的相對表達量。

2 結 果

2.1 PP242對高糖培養的足細胞增殖的影響 細胞分組培養48 h后，高糖組足細胞增殖明顯受到抑制，與正常組比較差異有統計學意義(P<0.05)；與高糖組比較，PP242干預1組、PP242干預2組細胞增殖明顯升高(P<0.05)，且隨著PP242濃度的增大，作用更加明顯，呈一定的劑量-效應關系。詳見表1。

表1 各組足細胞增殖的吸光度值(OD490)比較(±s)

2.2 PP242對高糖培養的足細胞凋亡的影響 細胞分組培養48 h后，正常組足細胞凋亡率為(4.0±0.7)%，高糖組足細胞凋亡率為(18.8±0.6)%，高糖組足細胞凋亡率高于正常組(P<0.05)。高糖培養足細胞經PP242干預后，足細胞凋亡率較高糖組明顯下降(P<0.05)，其中PP242干預1組足細胞凋亡率為(12.5±0.9)%，PP242干預2組足細胞凋亡率為(9.1±0.6)%，提示高濃度PP242干預后足細胞凋亡率更低。詳見圖1、圖2。

圖1 流式細胞儀檢測足細胞凋亡情況

與正常組比較，*P<0.05；與高糖組比較，# P<0.05。

2.3 Western Blot檢測Podocin蛋白表達的變化 高糖培養足細胞48 h后，高糖組足細胞Podocin蛋白表達下降，與正常組比較差異有統計學意義(P<0.05)；高糖培養并經PP242干預后，PP242干預1組、PP242干預2組Podocin蛋白表達較高糖組明顯上升(P<0.05)。詳見圖3。

A：正常組；B：高糖組；C：PP242干預1組；D：PP242干預2組。與正常組比較，*P<0.05；與高糖組比較，# P<0.05。

3 討 論

目前認為，糖尿病腎病引起的足細胞損傷，主要包括足細胞肥大、足細胞凋亡、足細胞脫離以及足細胞向上皮間充質轉分化[2]。而高糖引起足細胞損傷的機制可能為氧化應激損傷、微RNA、自噬以及外泌體等[3-4]。mTOR信號通路在信號轉導、細胞自噬與細胞凋亡中起重要作用[5]。mTOR是自噬的負性調控因子，而mTOR特異性抑制劑(如雷帕霉素)與mTOR特異性結合后，可抑制mTOR的蛋白激酶活性，通過增加自噬來維持足細胞的自身穩態，抵御高糖的作用，減少細胞凋亡[6]。本研究旨在觀察新一代mTOR抑制劑PP242對高糖引起的足細胞損傷有無保護作用。

本研究結果提示，高糖培養足細胞后，足細胞增殖明顯減少，但同時加入PP242后，足細胞的細胞存活率較高糖組有所提高。高糖誘導足細胞后，足細胞凋亡增加，經PP242干預后，足細胞的凋亡率較高糖組降低。說明PP242可在一定程度上減弱高糖對足細胞增殖抑制的影響，PP242也可減少高糖引起的足細胞凋亡。PP242也是一種自噬誘導劑，對腫瘤壞死因子-α所致的腸屏障損傷、多囊腎大鼠膽管上皮細胞都有誘導自噬的作用[7-8]。

在對糖尿病腎病的研究中發現，足細胞的裂孔隔膜受損、足突發生融合以及足細胞從基底膜脫落，導致大量蛋白尿的產生。雷帕霉素具有減少實驗動物蛋白尿的作用，可能與減少腎小球濾過屏障的通透性，上調Nephrin和Podocin蛋白的表達有關[9-10]。Nephrin、 Podocin與CD2AP 組成的復合體在維持裂孔隔膜結構的完整性上起到了重要作用[11]。Podocin是NPHS2基因產物，Podocin在介導裂孔隔膜與足細胞骨架連接方面發揮整合的作用。以往研究表明，糖尿病腎病鼠腎臟Nephrin和 Podocin蛋白表達下降。高糖刺激足細胞后，也可以引起足細胞出現Nephrin和 Podocin蛋白表達下降[10，12]，與本研究結果一致。PP242可以部分恢復Podocin蛋白表達，從而維護裂孔隔膜的完整性。因此，對于高糖引起的腎小球足細胞增殖、凋亡的影響以及Podocin蛋白表達的變化，PP242都有一定程度的干預作用，具有潛在的足細胞保護作用。