血漿纖維蛋白原基因多態(tài)性、肥胖與缺血性腦卒中的關(guān)系探討

段家樂，張曉敏，孟鵬飛，鄭輯英

缺血性腦卒中主要是因腦部供血動脈狹窄或閉塞、腦供血不足導(dǎo)致的腦組織壞死的總稱，又被稱之為腦梗死，病人常伴有頭暈、手腳麻木等癥狀，嚴(yán)重者會出現(xiàn)肢體功能障礙、語言障礙，甚至死亡。因此，分析出現(xiàn)缺血性腦卒中的危險因素，并給予針對性干預(yù)，對降低缺血性腦卒中致殘率、致死率極為重要[1-2]。有報道指出，肥胖是腦卒中出現(xiàn)的主要誘因，肥胖者往往存在血脂、血壓升高，會增加病人出現(xiàn)粥樣硬化性斑塊的危險性，從而增加罹患缺血性腦卒中的風(fēng)險[3]。血漿纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)g)含量也與缺血性腦卒中的出現(xiàn)存在密不可分的關(guān)系，F(xiàn)gβ-148C/T是調(diào)控機(jī)體分泌Fg的主要基因，當(dāng)該基因出現(xiàn)突變時會影響Fg的分泌，使機(jī)體凝血反應(yīng)出現(xiàn)異常[4]。本研究通過分析腦卒中病人及健康受試者的Fgβ-148C/T基因多態(tài)性及體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)，旨在探究其與缺血性腦卒中發(fā)生的關(guān)系，并分析影響缺血性腦卒中發(fā)生的危險因素，為該疾病的治療及預(yù)防提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年3月—2018年5月山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院收治的缺血性腦卒中病人120例為缺血性腦卒中組，并以同期健康體檢者80名為健康對照組。缺血性腦卒中組120例，男71例，女49例，年齡45～76(58.16±7.93)歲；健康對照組80名，男49名，女31名；年齡42～75(57.24±8.05)歲。兩組受試者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核通過。

1.2 缺血性腦卒中病人納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》關(guān)于缺血性腦卒中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②為首次出現(xiàn)缺血性腦卒中；③病人知情同意并簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①嚴(yán)重心、肝、腎功能異常病人；②出血性腦卒中病人；③腦腫瘤病人；④有顱腦手術(shù)史病人；⑤其他腦部疾病病人。

1.4 方法

1.4.1 Fgβ-148C/T基因多態(tài)性 ①標(biāo)本采集：取病人入院后24 h內(nèi)空腹靜脈血5 mL，于4 ℃環(huán)境下，放置于EDTA抗凝無菌試管中保存待用。②DNA提取：在1.5 mL試管中加入750 μL細(xì)胞裂解液+300 μL枸櫞酸鈉抗凝劑，多次混勻，然后進(jìn)行離心處理，10 000 r/min離心20 s，取下層白色沉淀物，加入150 μL緩沖液(Fg與蛋白酶K的混合液)，混勻震蕩至沉淀物溶解，在65 ℃水浴環(huán)境下反應(yīng)10 min，然后加入150 μL異丙醇，使其反應(yīng)至出現(xiàn)絲狀基因組DNA后進(jìn)行離心處理3 min，棄上清液。在沉淀物中加入70%乙醇150 μL，應(yīng)用離心機(jī)離心處理3 min，保留下層沉淀物，重復(fù)此操作2次，將多余液體揮發(fā)干凈后加入緩沖液TB 200 μL，低速渦旋5 s，在65 ℃水浴鍋中加熱30 min左右，加熱過程中輕輕敲打試管幫助溶解，完成后放置于4 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩＂跴CR擴(kuò)增：Fgβ-148C/T引物序列，上游引物5′-CGTAACTTCCCATCATTTTGTC-3′， 下游引物5′-ATGGTTTTAAGTTTGTGGAAGC-3′，反應(yīng)體系參照黃桂鳳等[6]研究，混勻后用50 μL液狀石蠟油，共反應(yīng)35個循環(huán)(94 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 30 s)，反應(yīng)完成后放置于4 ℃環(huán)境下。④多態(tài)性分析：取10 μL PCR產(chǎn)物在37 ℃環(huán)境下加入0.2 μL 牛血清白蛋白(BSA)、2 μL Buffer、3.8 mL 雙蒸水(ddH2O)、1 μL 10 U/μL 限制性內(nèi)切酶(HindⅢ)，孵育3 h后，采用瓊脂凝膠電泳30 min，應(yīng)用紫外檢測儀分析電泳結(jié)果。

1.4.2 BMI測定 于病人入院24 h內(nèi)，應(yīng)用身高、體重測量儀器檢測病人身高、體重，計算BMI=體重(kg)/身高(m)2。

1.5 觀察指標(biāo) ①分析Fg基因多態(tài)性在健康對照組及缺血性腦卒中組中的分布特點(diǎn)及與缺血性腦卒中發(fā)生的關(guān)系。②比較兩組受試者BMI，分析肥胖(BMI≥28 kg/m2)與缺血性腦卒中發(fā)生的關(guān)系。③收集病人一般資料，主要包括吸煙(平均≥1支/日)、飲酒(每周≥120 mL)、腦卒中家族史(直系親屬中有患腦卒中者)、高血壓史[連續(xù)3次檢測血壓均≥140/90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)或開始服用相關(guān)降壓藥物]、糖尿病病史(空腹血糖≥7 mmol/L或餐后血糖≥10 mmol/L，開始服用降糖藥物)、高脂血癥病史(開始服用降脂藥物)、心臟病史(心肌缺血、心肌梗死、冠心病等)等，采用多元Logistics回歸分析影響缺血性腦卒中發(fā)生的危險因素。

2 結(jié) 果

2.1 兩組Fgβ-148C/T基因多態(tài)性分布 在Fgβ-148C/T基因中，缺血性腦卒中組CT基因型頻率及C等位基因頻率低于健康對照組(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組Fgβ-148C/T基因多態(tài)性分布 單位：例(%)

2.2 兩組BMI比較 缺血性腦卒中組BMI為(27.53±3.12)kg/m2，高于健康對照組的(23.59±2.37)kg/m2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.596，P=0.000)。

2.3 相關(guān)性分析 Fgβ-148C/T基因中T基因出現(xiàn)頻率、BMI值與缺血性腦卒中發(fā)生呈正相關(guān)(r=0.166，P=0.000；r=0.620，P=0.000)。

2.4 缺血性腦卒中的危險因素分析 腦卒中家族史、肥胖、Fgβ-148C/T基因多態(tài)性、高血壓、糖尿病、高脂血癥、心臟病是缺血性腦卒中發(fā)生的獨(dú)立危險因素(P<0.05)。詳見表2。

表2 缺血性腦卒中的危險因素分析

3 討 論

Fg又稱為凝血因子1，是一種由肝臟合成的具有凝血功能的蛋白質(zhì)，是纖維蛋白的前體，具有雙重生物活性，既是凝血酶作用的底物，參與凝血反應(yīng)的過程，又是纖溶酶的靶物質(zhì)，在凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，并且血漿Fg含量過高時會與血小板膜糖蛋白結(jié)合，導(dǎo)致血小板聚集，促進(jìn)血栓的形成，影響血液循環(huán)過程，從而增加病人出現(xiàn)缺血性腦卒中的危險性[7]。有報道指出，F(xiàn)gβ-148C/T基因多態(tài)性與血漿Fg水平存在密不可分的聯(lián)系，且其是影響基因轉(zhuǎn)錄的重要位點(diǎn)[8]。Fgβ-148C/T位于Fgβ基因5′端啟動區(qū)，主要受皮質(zhì)激素及肝細(xì)胞刺激因子的調(diào)控，與紅細(xì)胞的生理功能及血小板、白細(xì)胞的生成相關(guān)，而缺血性腦卒中病人普遍存在血小板異常聚集的現(xiàn)象，會影響機(jī)體激素代謝和炎癥反應(yīng)過程，從而導(dǎo)致Fgβ-148C/T基因突變[9-10]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)gβ-148C/T基因中，缺血性腦卒中組CT基因型頻率及C等位基因頻率低于健康對照組，說明缺血性腦卒中病人Fgβ-148C/T基因中CT基因型頻率及C等位基因頻率偏低，這提示Fgβ-148C/T基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的發(fā)生過程有關(guān)。Fgβ-148C/T基因突變時會改變細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子與對應(yīng)位點(diǎn)的親和力，影響Fg轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致Fg分泌異常[11]。而缺血性腦卒中病人因普遍存在血漿Fg水平偏高的現(xiàn)象，這可能與Fgβ-148C/T多態(tài)性有關(guān)。黃華佗等[12]研究表明，F(xiàn)gβ-148C/T基因型與頸動脈粥樣硬化的程度有關(guān)，而頸動脈粥樣硬化是誘發(fā)缺血性腦卒中的主要原因，這表明Fgβ-148C/T基因多態(tài)性可能與缺血性腦卒中的發(fā)生過程有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)gβ-148C/T基因多態(tài)性是影響缺血性腦卒中發(fā)生的獨(dú)立危險因素，F(xiàn)gβ-148C/T基因中T基因出現(xiàn)頻率與缺血性腦卒中發(fā)生呈正相關(guān)，這表明可通過檢測病人Fgβ-148C/T基因多態(tài)性來初步預(yù)測缺血性腦卒中的發(fā)生概率。缺血性腦卒中是指腦血管發(fā)生堵塞造成腦局部組織功能喪失引起的臨床一系列綜合征[13]。BMI的增加會導(dǎo)致血壓增高、脈壓增大，并且會導(dǎo)致血壓變異性增加，過度脂肪堆積也會導(dǎo)致動脈血管彈性減退，影響血管內(nèi)皮功能，從而使發(fā)生腦卒中的危險性增加[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中組BMI值高于健康對照組，BMI值與缺血性腦卒中發(fā)生呈正相關(guān)，說明病人BMI值越高，出現(xiàn)缺血性腦卒中的概率越大，這表明肥胖可能與病人出現(xiàn)缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)。本研究進(jìn)一步證實(shí)肥胖是影響缺血性腦卒中發(fā)生的危險因素，這主要是因?yàn)榉逝植∪送橛醒⒀獕哼^高，且其動脈硬化程度較為嚴(yán)重，使血脂堆積于血管壁造成管腔狹窄，最終導(dǎo)致腦血管堵塞，影響腦組織內(nèi)血液流通，進(jìn)而誘發(fā)缺血性腦卒中。

相關(guān)報道指出，患有糖尿病、高脂血癥等基礎(chǔ)疾病的病人出現(xiàn)缺血性腦卒中的概率高于健康人群，提示基礎(chǔ)疾病可能與缺血性腦卒中的發(fā)生過程有關(guān)[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病、高脂血癥、心臟病是影響缺血性腦卒中發(fā)生的獨(dú)立危險因素，這主要是因?yàn)樘悄虿〔粌H會影響血液微循環(huán)，而且會使大腦、眼球等部位毛細(xì)血管基底膜增厚，而高脂血癥、心臟病會影響血小板的黏附和凝聚，加重動脈粥樣硬化程度，導(dǎo)致缺血性腦卒中發(fā)生的危險性升高。

綜上所述，病人Fgβ-148C/T基因中T基因出現(xiàn)頻率、BMI值與出現(xiàn)缺血性腦卒中呈正相關(guān)，腦卒中家族史、肥胖、Fgβ-148C/T基因多態(tài)性、高血壓、糖尿病、高脂血癥、心臟病是影響缺血性腦卒中發(fā)生的獨(dú)立危險因素。因此，可通過控制血壓、血糖、血脂及BMI值來降低缺血性腦卒中發(fā)生的危險性。