基于網絡藥理學研究女貞子-淫羊藿藥對活性成分抗骨質疏松的分子機制

陳楠 宋紅 沙南南 王擁軍,3 張巖,3*

1.上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 2000322.貴州省骨科醫院，貴州 貴陽 5500023.教育部筋骨理論與治法重點實驗室，上海 200032

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種常見的骨代謝疾病，其主要特征為骨密度降低和骨微結構破壞[1-2]。據估計，全世界約有30%的婦女和12%的男性受到OP的影響，全球每年會有890萬人發生骨折[3-4]。但是在臨床藥物只能發揮改善癥狀的作用，并不能有效抑制OP的進一步發展[5]。隨著中醫藥事業的發展，中藥在治療OP方面的多成分、多機制的優勢也逐漸被發掘出來，所以從OP的發生機制上尋找中藥中的有效成分，并做出科學闡述，能夠發揮傳統中藥在治療OP方面的獨特優勢。

女貞子為木犀科植物女貞的干燥成熟果實，首次記載于《神農本草經》，具有滋補肝腎、養血益陰的作用，用于臨床治療OP也有千年歷史上[6-7]。現代科學研究發現，中藥女貞子化學成分多達100多種，其中以多糖、黃酮類等為主[8]。具有多種藥理作用，包括抗OP[9]、抗氧化[10]、抗衰老[11]、抗癌[12]、抗糖尿病[13]等。中藥淫羊藿為小檗科淫羊藿屬植物，最初記載于《神農本草經》，主要發揮補足腎陽、強健筋骨作用，應用廣泛[14]。同時研究發現，淫羊藿含有260多種有效成分，包括黃酮、多糖、生物堿等[15]。淫羊藿藥理學作用包括抗OP、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化[16]。有研究表明[17-18]，女貞子和淫羊藿的藥對配伍對OP有很大的改善和治療作用，所以揭示其分子機制也有利于女貞子-淫羊藿藥對基礎和臨床的使用及推廣。

1 資料與方法

1.1 女貞子-淫羊藿中活性成分的篩選

TCMSP數據庫中收錄約502味中藥，及對應約12 144個相關中藥成分，并對每個中藥的化合物按照藥代動力學參數進行分類，同時對應上相關疾病[19]。本研究通過檢索TCMSP數據庫，分別以女貞子和淫羊藿為關鍵詞，其中篩選條件設置為類藥性(DL)≥ 0.18、口服生物吸收利用度(OB)≥30%，將獲取的女貞子和淫羊藿的所有活性成分進行查重和整合。

1.2 疾病靶點的獲取

DrugBank數據庫是包含有關藥物及其機制的全面分子信息[20](同時還包括DisGeNET[21]、TTD[22]、OMIM 數據庫[23]、GAD數據庫[24]、PharmGKB數據庫[25]、GeneCards數據庫[26])，設置“osteoporosis”為關鍵詞在以上7個數據庫中進行檢索，并對檢索結果進行整理，查重和整合所有靶點即為OP的所有已知靶點。

1.3 中藥活性成分和疾病靶點基因的獲取

使用UniProt數據庫[27]，種族設置為Human，查詢中藥活性成分和疾病靶點對應靶點，將OP已知相關靶點使用UniProt查出對應靶點基因，并繪制維恩圖獲得女貞子-淫羊藿活性成分潛在抗OP的作用靶點基因。

1.4 女貞子與淫羊藿“活性成分-靶點基因網絡”的構建

用軟件Cytoscape3.7.1對其進行構造，作網絡可視化分析圖[28]。將從上述獲得的女貞子與淫羊藿的有效活性成分和靶點基因導入軟件Cytoscape3.7.1，篩選出女貞子-淫羊藿有效活性成分及其對應靶點基因，同時結合文獻研究，整理和分析其中的相互作用。

1.5 關鍵靶點生物功能注釋及通路分析

DAVID是一個信息數據庫，可以對靶點的功能和通路進行KEGG通路分析，通過信號通路對疾病闡述中藥的獨特優勢[29]。在DAVID數據庫中依次輸入女貞子、淫羊藿和OP的關鍵靶點，在通路分析選項設置KEGG，以P<0.05為標準進行信號通路篩選。

2 結果

2.1 女貞子-淫羊藿有效活性成分的篩選

通過TCMSP數據庫，檢索發現女貞子化學成分共有119個，淫羊藿化學成分共有130個，通過DL≥0.18和OB≥30%進一步篩選得到其潛在活性化合物，其中女貞子有13個，淫羊藿有23個(表1)，使用Draw Venn Diagram平臺將中藥活性成分劃分并繪制維恩圖(圖1)。

圖1 女貞子-淫羊藿中潛在活性成分維恩圖Fig.1 Venn diagram of potential active components in Ligustrum lucidum and Epimedium

表1 女貞子-淫羊藿中潛在活性成分DL和OB值及其化學結構式Table 1 DL and OB values and chemical structure formula of potential active components in Ligustrum lucidum and Epimedium

續表1 女貞子-淫羊藿中潛在活性成分DL和OB值及其化學結構式Continued table 1 DL and OB values and chemical structure formula of potential active components in Ligustrum lucidum and Epimedium

2.2 女貞子與淫羊藿活性成分-靶點網絡圖

將女貞子和淫羊藿的33個潛在活性成分，及其對應的227個靶點進行構建網絡圖，見圖2。

圖2 中藥生物活性成分-靶點網絡圖Fig.2 Network diagram of bioactive components and targets of traditional Chinese medicine注：兩個八邊形：女貞子、淫羊藿兩味中藥；外圈圓形：潛在活性成分；中間四邊形：潛在活性成分對應靶點基因。

2.3 疾病-靶點網絡圖

將OP與其對應的190個靶點基因進行構建網絡圖，見圖3。

圖3 OP-靶點基因網絡圖Fig.3 OP target gene network注：中間圓形：骨質疏松；四周為骨質疏松治療的潛在靶點基因。

2.4 女貞子-淫羊藿成分抗OP的潛在作用靶點預測

將女貞子-淫羊藿成分靶點使用UniProt得到對應靶點基因，查重和整合得到女貞子和淫羊藿活性成分靶點基因各190個、216個[30]。繪制維恩圖將藥物與骨質疏松癥對應靶點基因188個進行分析(圖4)，最終獲得共同基因16個，其中歸屬女貞子的有15個，分別為TGFβ1、PGR、AR、ESR1、COL1A1、CA2、PPARG、NOS3、CYP3A4、TNF、STAT1、SELE、RUNX2、THBD、HK2；歸屬于淫羊藿的有15個，分別為TGFβ1、PGR、AR、ESR1、COL1A1、ESR2、PPARG、NOS3、CYP3A4、TNF、STAT1、SELE、RUNX2、THBD、HK2；兩者間共同靶點為14個，分別為TGFβ1、PGR、AR、ESR1、COL1A1、PPARG、NOS3、CYP3A4、TNF、STAT1、SELE、RUNX2、THBD、HK2。這提示女貞子與淫羊藿在抗OP治療過程中大多為共同的作用靶點發揮作用，同時又有其自己關鍵作用靶點可單獨發揮作用，兩藥可協同發揮抗OP作用。

圖4 女貞子-淫羊藿-OP靶點基因維恩圖Fig.4 Venn map of target gene of privet fructus ligustri lucidi-herba epimedii maxim-OP

2.5 藥物-活性成分-關鍵作用靶點網絡構建與分析

對女貞子-淫羊藿以及OP疾病共有靶點基因進行橋接，共獲得有效成分18個，有效靶點基因16個，見圖5。

圖5 中藥生物關鍵活性成分-OP靶點網絡圖Fig.5 Target network diagram of OP, a key bioactive component of traditional Chinese medicine注：上面兩個八邊形：女貞子、淫羊藿兩味中藥；中間四邊形：有效成分；下面圓形：有效靶點基因。

2.6 女貞子-淫羊藿治療OP機制通路分析

KEGG通路富集分析女貞子-淫羊藿的14個潛在關鍵靶點基因，發現共有12條信號通路發揮作用(圖6)，其中選擇相關性最大的前10條通路分別為破骨細胞分化通路(圖7)、癌癥途徑、癌癥的蛋白多糖通路、結核病通路、乙型肝炎通路、弓形蟲病通路、阿米巴病通路、利什曼病通路、炎癥性腸病通路、瘧疾通路、非洲錐蟲病通路、II型糖尿病通路，表明女貞子-淫羊藿藥對可能通過這些信號通路協調發揮抗OP作用。采用OmicShare對通路進行分析，結果發現女貞子-淫羊藿藥對關鍵靶點基因富集于多種OP通路上，提示此通路可作為未來研究女貞子-淫羊藿抗OP的重要方向。

圖6 女貞子-淫羊藿抗OP的信號通路富集分析Fig.6 Enrichment analysis of anti OP signal pathway of Ligustrum lucidum and Epimedium

圖7 女貞子-淫羊藿抗OP的KEGG信號通路Fig.7 KEGG signaling pathway of Ligustrum lucidum-Epimedium against OP注：粗框：女貞子和淫羊藿藥對治療OP的有效靶點。

3 討論

基于中醫“腎藏精，主骨、生髓”理論，腎虛是OP癥的主要發病機制[31]。女貞子、淫羊藿作為兩味常用治療腎虛中藥，其中女貞子以治療腎陰虛為主，淫羊藿以治療腎陽虛為主，以“陰陽雙補，益精壯骨”的立法將二者配伍用于臨床治療OP已接近50年之久[32]。目前許多臨床研究認為女貞子-淫羊藿藥對在治療糖皮質激素所致OP方面療效顯著[33]，同時女貞子-淫羊藿藥對在調節患者機體免疫功能和預防疾病作用明顯[34-35]。

通過本研究中所有網絡圖顯示，山奈酚(kaempferol)及槲皮素(quercetin)為女貞子和淫羊藿共有活性成分，除此之外還有淫羊藿苷(icariin)、去水淫羊藿黃素(anhydroicaritin)和木犀草素(luteolin)均為網絡中的重要節點，說明這些潛在有效化合物在女貞子-淫羊藿藥對抗OP治療中發揮著重要作用，這與目前的基礎和臨床的相關研究結果基本保持一致，同時也提高了本研究中對預測結果的可信度。研究表明山奈酚可以顯著抑制去卵巢(OVX)大鼠骨吸收，改善骨小梁微結構[36]，而且山奈酚可以減緩OVX模型后引起的體重增加，并且不會引起子宮內膜肥大[37]。共有活性成分槲皮素可以使糖皮質激素誘導的OP癥大鼠的股骨骨小梁密度和皮質骨骨厚度增加[38]。也有文獻指出[39]，當給藥TNF-α刺激骨髓間充質干細胞(BMSCs)時，會誘導BMSCs的核因子κB(NF-κB)的激活和β-連環蛋白的降解，而此時可以通過槲皮素抑制這個過程，并促進BMSCs增殖和其向成骨分化，增加成骨細胞。維生素D受體(VDR)的激活被認為是治療OP的潛在藥物靶標，有研究報道槲皮素可以激活VDR與配體結合的結構域。此外，該研究還證實槲皮素提高了Caco-2細胞中VDR靶基因TRPV6 mRNA表達水平。以上結果表明，槲皮素可作為VDR的激動劑起到抗OP作用[40]。

本研究通過藥物有效活性成分及其對應靶點和疾病靶點的對應匹配構建的網絡圖，最終獲取得到女貞子-淫羊藿藥對在治療OP方面的關鍵靶點基因共16個，其中女貞子15個，淫羊藿15個，兩者共有的靶點有14個，進一步發現有效的治療靶點蛋白有TNF、PPARG、STAT1、TGFB1，而這4個關鍵靶點在抗骨質疏松的信號通路中均占有重要地位，可作為女貞子-淫羊藿藥對抗OP的重要靶點蛋白。在KEGG 信號通路富集分析的結構中也顯示，這4個關鍵靶點富集的通路主要為破骨細胞分化通路等，結合目前基礎和臨床的研究中，女貞子-淫羊藿的配伍發揮抗OP機制及所對應的通路中都有所體現。KEGG信號通路富集分析結果也表明女貞子-淫羊藿藥對的多種活性成分對應的關鍵靶點作用于多種有效通路，正符合中醫藥獨特優勢，不同成分、靶點和通路之間的相互協調共同發揮治療OP的作用，初步證明女貞子和淫羊藿配伍治療OP的科學性，為進一步深入探討其作用機制以及研發防治骨質疏松新藥提供了新方向。