川續斷提取物續斷皂苷Ⅵ防治骨質疏松癥的研究進展

趙金龍 梁桂洪 韓燕鴻 潘建科 曾令烽 李嘉暉 趙第 劉軍*

1.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東 廣州 5104052.廣東省中醫藥科學院骨與關節退變及損傷研究團隊，廣東 廣州 5101203.廣州中醫藥大學第二附屬醫院(廣東省中醫院)，廣東 廣州 510120

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是以低骨量和骨組織的微結構退化，導致骨骼脆弱性增強和骨折風險增加為臨床特征的一類全身性代謝性骨骼疾病[1-2]。OP為臨床常見且難于治療的骨代謝性疾病，其繼發性疾病可致殘、致死，如骨質疏松性骨折、嚴重髖部骨折后臥床引發的并發癥、影響呼吸系統等[3]，影響老年人的健康生存質量。目前，我國超過60歲以上人口已達2.1億，65歲以上人口約1.4億，老年人口絕對數目已經世界第一，隨著人口老齡化的發展，OP已成為我國面臨的重要公共健康問題[4-5]。骨代謝平衡狀態直接影響骨質疏松癥的發生發展，根據骨質疏松的發生機制，臨床用藥主要以促進骨形成或抑制骨吸收作為主要的治療思路[6]，但目前臨床所應用的抗骨質疏松藥物均存在不同程度的缺陷，臨床上使用的抗骨質疏松藥物均具有一定的不良反應[7-8]。現代藥理學研究結果發現[9-10]，川續斷在抗骨質疏松領域具有較好的臨床療效，其中其主要化學單體續斷皂苷Ⅵ(asperosaponin Ⅵ)，又名木通皂苷D(akebia saponin D，ASD)，具有較強的抗OP功效[11-12]。本綜述將從ASD治療骨質疏松的細胞水平層面及相關生物學通路進行分析總結，以期為今后的ASD抗骨質疏松相關動物實驗、臨床研究提供一定的指導，進而為ASD等中藥單體抗骨質疏松的精準、靶向治療提供一定的參考。

1 續斷和ASD的提取

1.1 續斷

續斷為中醫藥學補陽之要藥，為多年生草本植物川續斷Dipsacus asper Wall. Ex Henry的干燥根，性溫，味苦、甘，歸肝腎經，入藥可補肝腎，強筋骨，續折傷，止崩漏[13]。本藥首次記載于《神農本草經》：“主傷寒，補不足，金瘡，癰瘍，折跌，續筋骨，婦人乳難”。《神農本草疏》云：“入足厥陰、少陰，為治胎產，續絕傷，補不足，療金瘡，理腰腎之要藥也”。《本草匯言》稱：“續斷，補續血脈之藥也”“所傷之筋，非此不養”。以上古籍記載均肯定了續斷治療骨傷科疾病的作用，現代臨床上續斷也被廣泛應用于骨質疏松癥、骨關節炎等[13-14]。中醫藥學認為，續斷可以補益肝腎，強筋健骨，可用于治療風濕痹痛、療筋續斷。現代研究結果表明[15]，續斷具有改善免疫、促進骨損傷愈合、抗菌、抗炎等作用。高歌等[16]研究發現，續斷可能是通過AKT1、MAPK1等影響PI3K-AKT生物學通路，參與破骨細胞的調控，進而起到抗骨質疏松的生物學效應。

1.2 ASD的提取及現代提取工藝研究

ASD的提取一般采用超聲法或回流法，朱海琳等[17]認為在單因素試驗中，超聲法及回流法對ASD提取的轉移率沒有明顯差異。乙醇回流法也被廣泛應用于ASD的提取工藝中，但乙醇或其他醇類回流法的提取過程中會消耗大量乙醇等溶劑，此種提取方法耗費較大的經濟成本，但具有效率高、周期短、后期處理方便等優點[18]。古丹丹等[19]采用單因素實驗與正交試驗相結合的方法，結果發現乙醇回流提取ASD具有較高的效率以及可操作性，該實驗以ASD轉移率為評價標準，其研究認為ASD在乙醇回流法中最佳的提取方法是使用6倍濃度為65%的乙醇共提取3次，每次2 h，該實驗中采用此種提取方法得出的ASD轉移率為101.52%。超聲法在中藥成分的提取應用中，體現出了具有提取時間短、提出率高、設備簡單等益處，在中藥成分的提取應用中得到廣泛的認可[20]。朱海琳等[21]采用響應面法進一步優化續斷ASD的超聲提取工藝進行研究，以ASD轉移率為評價標準，根據相關的實驗數據及數學方程式確定ASD的最佳提取工藝參數：超聲時間 33.13 min，乙醇濃度51.58%，液料比23.39 mL/g，該研究中采用該實驗參數得到的ASD轉移率為(88.39±0.21)%，該研究進一步為超聲提取方法的工藝參數提供了可靠的依據，為進一步的ASD提取工藝發展及其他中藥成分的提取提供了借鑒。

2 ASD促進骨形成研究

2.1 ASD對BMSCs成骨分化及相關信號通路研究

OP是由于成骨細胞(osteoblasts，OB)活性的減弱或破骨細胞活性的增加而導致骨骼密度的減少、骨骼脆性增加。成骨細胞的生物學過程與骨質疏松的發生發展密切相連，而成骨細胞的重要來源為骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)，BMSCs在相關的轉錄因子及細胞因子的推動下，能夠進一步分化為成骨細胞，從而促進骨形成[12,18]，可見BMSCs在人類骨骼代謝中至關重要。Cai等[22]研究人員認為BMSCs與OP的發生發展關系密切，BMSCs的分化程度可能直接影響OP的發展進程，因此對BMSCs的生物學過程向著有利于控制骨質疏松方向進行調控，可以作為防治骨質疏松的思路和手段。李家等[23]研究人員發現ASD可以促進BMSCs的分化，提升BMSCs的細胞活力，從而促進骨形成，增加骨量，改善骨小梁的微觀結構。相關基礎實驗發現[24]，ASD可以促進大鼠體外MSCs向成骨細胞方向進行增值分化，從而促進骨形成，防治骨質疏松，該生物學效應的發揮可能與其升高Cbfa1 mRNA的表達有一定聯系。

黃媛等[25]認為ASD可以誘導BMSCs分化成為成骨細胞，其中c-Jun和轉錄激活因子4(ATF4)、骨形態發生蛋白2(BMP-2)在其中發揮了關鍵性作用，可能與BMP-2在一定程度上誘導c-Jun等的磷酸化，激活了JNK信號通路，在其研究中通過抑制JNK通路，成骨細胞的分化、骨鈣素的表達及ALP活性均受到不同程度的抑制，因此認為ASD可以通過JNK信號通路促進BMSCs分化，從而防治骨質疏松。另有相關研究認為[23]，ASD促進了BMSCs的成骨分化，其中Wnt信號通路可能發揮了較重要的作用，ASD可以升高BMP-2、Runx2等基因的表達，而Wnt信號阻斷劑可以阻斷或減少此類成骨基因的作用，基于此原理，ASD可能是通過干預Wnt通路，削減Wnt信號阻斷劑的作用，促進相關成骨基因的表達，起到增加骨量、改善骨小梁微結構的作用。另有觀點認為[12,26]，ASD在可以促進大鼠BMSCs向成骨細胞分化，該生物學效應的發揮可能與MAPK途徑的p38 MAPK和細胞外信號調節激酶(ERK)蛋白存在密切的聯系。

2.2 ASD對成骨細胞成骨的影響及相關信號通路研究

ASD可推動成骨細胞前體細胞(MC3T3-E1)和原代成骨細胞的生化進展過程，包括繁殖、分化等，ASD可以提升成骨細胞ALP的生物學活性，促進骨形態發生蛋白-2(BMP-2)的合成，同時激活p38 MAPK和ERK1/2進而推動骨形成[27-28]。張云輝等[27]研究認為ASD可以推動骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，這進一步揭示ASD對于成骨細胞的影響，主要通過影響骨髓間充質干細胞的繁殖、分化。經過筆者對大量ASD對成骨細胞影響的文獻研究發現[9, 23-24, 27]，現有研究認為ASD對成骨細胞的影響，主要是通過調控BMSCs的發生、發展間接促進成骨，進而產生抗OP的作用。

BMP-2與BMP受體兩者相結合，可誘導形成異源復合物受體，進一步推動MAPK信號通路中ERK1/2蛋白的磷酸化[29]。ERK1/2蛋白的激活可以逆向促進BMP-2蛋白的表達，從而促進成骨細胞的分化和成熟，因此在促進成骨細胞的分化與成熟過程中，MAPK信號通路發揮著至關重要的作用[9,27]。有研究發現[23]，ASD可以促進β-catenin、Runx2以及OCN基因的表達，而通過使用Wnt信號阻斷劑對BMSCs進行預先處理后，可以降低ASD誘導的成骨基因表達，這從側面印證了ASD可通過W nt/β-catenin信號通路促成骨分化。有研究[25]將JNK信號通路阻斷后，ASD誘導成骨分化的生物學過程受到抑制，因此JNK信號通路的激活可能是ASD促進成骨細胞分化的其中一種分子機制。Ke等[11]研究認為，ASD具有促進卵母細胞增殖、成骨分化和礦化的作用，ASD可以促進BMP-2表達和p38 MAPK和ERK1/2活化，證實其在促進成骨細胞分化中的作用依賴于BMP-2等[30]，Runx2的表達增加依賴于PI3K/AKT信號通路。BMP-2能夠促進成骨基因RUNX2的表達，Runx2能夠通過增加PI3K、AKT的蛋白水平來提高PI3K/AKT信號通路的活性。此外，PI3K/Akt信號增強了Runx2和 Runx2依賴轉錄的DNA結合，這種正反饋回路進一步增強了成骨細胞分化過程中Runx2的活性[31]，因此ASD的成骨分化可能與PI3K/AKT信號通路密切相關。

3 ASD對破骨細胞活性影響的研究

OP的發病機制主要與骨形成及骨吸收兩者的代謝失衡密切相關，破骨細胞(osteoclast，OC)的生物學活動在OP的發生發展過程中發揮著重要的作用。現已發表的中外文獻中，闡述ASD在破骨細胞層面發揮生物學作用的研究尚少，主要集中在口腔醫學領域，涉及ASD在生物學通路調控破骨細胞治療OP或骨代謝相關疾病的研究尚缺。現關于ASD與破骨細胞的研究，主要是通過牙科領域動物實驗模型證實了ASD可以增強牙周破骨細胞的活性，促進牙槽吸收及重建。陳佩佩等[32-33]研究ASD對大鼠正畸牙周組織改建的影響中發現，局部注射ASD可明顯促進壓力側牙周組織破骨細胞的活性，促進破骨細胞的形成，進而推動牙周改建的進程并加速正畸牙移動。亦有研究結果認為[34]，ASD通過使血液循環代謝加快，間接推動破骨細胞功能活躍，而破骨細胞誘導的壓力側促進牙槽骨吸收，并且認為成骨細胞發揮著重要的調控作用，而在在張力側會促進新骨生成，新骨的生成也需要成骨細胞干預，而ASD對牙周成骨細胞的作用仍需進一步探討。鑒于目前闡述ASD與破骨細胞之間關系的研究有限，ASD是否能夠對牙周組織以外的破骨細胞產生生物學及藥理學上的干預，促進相關破骨細胞的凋亡或提升其活躍性，從而調整破骨細胞與成骨細胞的動態平衡，進而起到防治骨質疏松的作用，尚需大量的基礎實驗及臨床試驗進行發掘、研究及驗證。

4 小結

目前臨床上使用的骨質疏松藥物大部分為骨吸收抑制劑(如雌激素、降鈣素等)，而骨形成相關藥物不足，藥物的臨床療效主要是改善癥狀、延緩病情進展，仍然未能逆轉病情甚至治愈[35]，且大部分抗骨質疏松藥均存在一定的不良反應[36]。大量的實驗及臨床研究表明[10, 37]，續斷具有促進骨形成、防治OP的藥理功效。ASD具有通過多種生物學通路促進BMSCs向成骨細胞分化的潛在功效，從而起到防治OP的作用[23-25]。

ASD可以從多個細胞層次及不同的生物學信號通路調節骨代謝，從而起到抗骨質疏松的功用，主要表現在以下幾個方面：ASD可以促進BMSCs向成骨細胞方向進行繁殖、分化，可能是通過JNK、Wnt、p38 MAPK等信號通路促進BMSCs分化，促進骨形成，從而防治骨質疏松；ASD可以通過多條生物學信號通路影響成骨細胞的繁殖及分化，其中可能與ASD調節骨細胞ALP、BMP-2、Runx2等細胞因子或蛋白成分，激活MAPK、β-catenin、PI3K/AKT等信號通路，進而促進骨形成，起到抗OP的作用(如圖1)。此外，本綜述發現目前闡述ASD與破骨細胞之間關系的研究十分有限，ASD是否能夠對牙周組織以外的破骨細胞有所抑制，從而調整破骨細胞與成骨細胞的動態平衡，進而起到防治骨質疏松的作用，或是ASD對于破骨細胞在人體不同部位的骨骼組織、骨代謝有著雙向調節作用，可抑制破骨細胞活性，亦可增強破骨細胞活動，尚需大量的基礎實驗及臨床試驗進行發掘、研究及驗證。

圖1 ASD抗骨質疏松的機制關系圖Fig.1 The mechanism of ASD against osteoporosis

綜上所述，ASD能夠在多個細胞層面以及通過多種信號通路對成骨細胞進行干預，起到增加骨骼密度，改善骨小梁微觀結構的效用，并能有效地防治骨質疏松及其繼發性疾病。許多國內外實驗及臨床研究結果表明，ASD在治療OP方面具有巨大的藥理學潛力及臨床應用價值，但目前以ASD單體成分研發的抗骨質疏松藥物尚無，部分藥理學作用機理仍不清楚，如ASD通過干預破骨細胞能否抗骨質疏松，因此ASD是否能進一步推廣應用于臨床，尚需要大量的基礎動物實驗、多中心臨床試驗提供有力的循證依據，以進一步明確ASD作用的生物學通路、作用靶點。