TREM2在阿爾茲海默癥中的研究進展

李曉月，倪賽佳，姚增瑩，張啟春

(南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023)

阿爾茲海默癥(Alzheimer′s disease,AD)是一種隱匿發生且發展緩慢的神經退行性疾病，最初在一個多世紀前由德國神經精神病學家Dr.Alois Alzheimer發現，到如今已被認為是癡呆性疾病中最常見的類型。其主要兩個病理特征為胞外淀粉樣-β(amyloid-β,Aβ)斑塊沉積及異常tau蛋白高磷酸化所致的神經纖維纏結。此外，AD還伴有腦內神經炎癥的發生，主要由腦內定居小膠質細胞對病理產物的免疫應答所致。根據臨床表征及遺傳風險程度，通常將AD分為3種類型：家族性AD、早發型AD及遲發型AD。已經明確的是家族性AD由編碼淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)、早老素1(PSEN1)、早老素2(PSEN2)的相關基因突變所引發。然而對于通常發生在65歲之后的遲發型AD，雖在AD患者中占比很大，卻并不表現攜帶任何家族性AD相關的基因突變，其發病原因目前尚不完全清楚，一般認為是多種因素(包括生物因素和社會因素)綜合作用下的結果。近年來發現TREM2編碼區的罕見突變可顯著提升阿爾茨海默病的患病風險[1]，因此對于TREM2的功能及其調節下的小膠質細胞在中樞神經系統疾病發生發展中的作用日漸成為關注的焦點。

1 TREM2的結構、配體及其相關信號通路

1.1 TREM2結構TREM2屬于免疫球蛋白超家族的一個單程傳遞膜受體，最初在單核細胞來源的樹突狀細胞和小鼠巨噬細胞中發現。TREM2基因位于人類6p21.1染色體，小鼠17C3染色體上具有免疫功能的基因簇內，其在外周主要于髓系細胞表達，如巨噬細胞、樹突狀細胞、粒細胞等。而在中樞神經系統，TREM2只由發揮主要免疫作用的小膠質細胞表達，且轉錄信號強度在基底神經節、胼胝體、延髓和脊髓顯示最強[2]。TREM2結構包括3部分：胞外區、無信號基序的跨膜結構域和胞質內部分，此外其跨膜區域還通過帶正電的賴氨酸殘基與DNAX活化蛋白12(DAP12，也稱作TYROBP)及DNAX活化蛋白10(DAP10)相關聯。TREM2胞外區包括單個免疫球蛋白結構域和柄區，研究發現在髓樣細胞受到諸如Toll樣受體配體或炎性細胞因子刺激信號激活后，胞外結構域會受到α-分泌酶解體蛋白ADAM17或ADAM10在柄區處的切割，釋放可溶形式的TREM2(sTREM2)至胞外，使細胞表面膜結合TREM2水平迅速降低[3]。

1.2sTREM2關于sTREM2發揮的生物學功能尚無確切定論，有報道表明這種TREM2經切割后的可溶形式產物是有一定活性的。研究發現，sTREM2可能會通過激活Akt-GSK3β-β-catenin信號通路減少小膠質細胞凋亡并依賴于 PI3K/Akt信號通路促進小膠質細胞的存活，發揮神經保護效應。此外，研究還表明，不論正常小鼠還是TREM2敲除小鼠，在向海馬區輸入sTREM2-Fc蛋白后，均能提高小鼠炎性因子表達水平，同時也會使小膠質細胞的形態發生改變，免疫應答能力增強。該文章提示增強sTREM2信號通路或許可作為AD的一種治療方式[4]，他們通過向5xFAD小鼠直接定向注射重組sTREM2蛋白或是腺病毒轉染的方式提高sTREM2的水平，發現其能促進淀粉樣斑塊附近小膠質細胞的增值及吞噬活性，加快對斑塊的吞噬清除而發揮保護作用。sTREM2能夠通過腦脊液-腦屏障，可在腦脊液中檢測到。當前已確證sTREM2可用來當作AD疾病檢測的標志物[5]，根據2018年發表的一篇報道，腦脊液sTREM2濃度與神經變性程度及tau蛋白纖維病理學指標相關，表明腦脊液sTREM2的水平可作為AD的臨床分類標準。而在最近的一篇文章，作者對攜帶6種不同TREM2罕見突變的AD患者的sTREM2的水平研究，發現各類TREM2突變下sTREM2表達水平異于TREM2突變不攜帶的AD患者，其中R47H突變的患者CSF中sTREM2平均水平明顯較其他類型突變者高。而至于生成增加的sTREM2是否使R47H突變患者有別于TREM2正常的AD患者還有待探究。此外，研究者在將病人根據AD不同臨床階段分類后，分別檢測了sTREM2與Aβ病理相關標志物及Tau蛋白病理相關標志物的關聯。結果表明，AD中sTREM2水平響應于Tau蛋白病理程度加重升高，而似乎不受Aβ病理狀況的影響[6]。對于sTREM2與Tau蛋白之間的聯系亦仍需探究。此外sTREM2在正常狀態的腦組織中也發揮著不可忽視的作用，在針對sTREM2與大腦結構關系的研究中，研究發現，CSF中sTREM2的表達水平能夠改變認知未受損的健康成年人腦容量及腦組織遷移率。

1.3 TREM2相關配體TREM2帶正電的功能部位會基于電荷基礎與其陰離子配體結合而被激活，其常見的配體有：細菌脂多糖、磷脂、載脂蛋白、細胞碎片、Aβ蛋白等。TREM2能夠與多種革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌及酵母菌結合，并促進細胞對其吞噬。TREM2敲除后，細胞對細菌的吞噬率會顯著降低，而在將TREM2和DAP12嵌合體導入非吞噬細胞后則可促進其對細菌的吞噬作用。TREM2與磷脂的結合也被廣泛證實，在小鼠的AD模型中發現，在Aβ蛋白積累及神經元丟失的誘導下會導致某些脂質的釋放，包括來自受損的神經元或膠質細胞的膜磷脂，如磷脂酰絲氨酸，這些脂質與TREM2結合后會激活TREM2受體，導致小膠質細胞的增殖效應的發生[7]。載脂蛋白E(APOE)是近年來發現的TREM2新型配體，其等位基因APOE4突變是研究最為明確的遲發型AD致病風險因子。去年Wang等[8]首次在人類系統模型上證實了APOE4導致AD的機制，他們利用源于誘導多能干細胞的表達ApoE4的人類神經元建立細胞模型，發現 ApoE4突變下神經元會有更嚴重的Tau蛋白磷酸化及Aβ蛋白水平，能夠導致GABA能神經元的退化，且此兩種病理下的產物不顯示相關性[8]。腦組織中，APOE由膠質細胞，且主要是由星形膠質細胞分泌，并經三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白A1(ABCA1)及三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白G1(ABCG1)脂質化[9]。生化檢驗分析發現，APOE與人類TREM2的結合具有高親和力[10]，此種結合可增加小膠質細胞對APOE結合的凋亡神經元的吞噬作用，而在TREM2突變下結合力會顯著降低[11]。

1.4 TREM2的相關信號通路DAP12是多種偶聯跨膜受體(如：CSF1R、TREM2)的接頭蛋白，也是目前發現的TREM2唯一的接頭蛋白，因此其在TREM2向胞內傳遞信息的過程中起到至關重要的作用。DAP12的突變也會直接導致某些疾病的發生，如：NHD[12]。在TREM2-DAP12-DAP10信號通路中，DAP12上所含有的免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM)磷酸化之后會通過募集酪氨酸蛋白激酶(SYK)向胞內傳遞信號，進而激活下游多個通路，如：細胞外調節蛋白激酶(ERK)、胞內磷脂酰肌醇激酶(PI3K)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt)，從而可能促進細胞表面TREM2的表達，促使小膠質細胞向吞噬及抗炎表型轉化[13]。而DAP10則在TREM2-DAP12信號通路募集PI3K的過程中發揮關鍵作用。有研究表明，含有Src同源結構域2(SH2)的物質，諸如肌醇磷酸酶-1(SHIP1)，則可以通過Src同源結構域2(SH2)與DAP12結合抑制PI3K的募集。而在γ-分泌酶作用下TREM2膜結合區域會發生降解，進而導致TREM2信號的減弱[14](Fig 1)。有研究者認為對α-分泌酶及γ-分泌酶的抑制也是AD的一種潛在治療手段[15]。

Fig 1 Structure and signaling pathways of TREM2

2 TREM2對小膠質細胞功能的影響

小膠質細胞是中樞神經系統的定居免疫細胞，正常狀態下約占中樞神經系統總細胞的10%，主要分布在黑質區域。它們最初起源于卵黃囊祖細胞，這些祖細胞會在胚胎發育第8.5 d通過血液循環遷移到發育中的中樞神經系統，且此過程會一直持續到中樞神經系統形成之前。不同于中樞神經系統中的其它細胞(包括大膠質細胞、神經元)均由神經外胚層分化而來，小膠質細胞來源于外周中胚層[17]，它們具有終生的分裂能力，無需來自外周髓系細胞的補充，雖在數量上并不顯優勢，但卻是中樞神經系統內的主要免疫細胞。

過去很長時間里，小膠質細胞所發揮的作用被嚴重低估。近年來隨著小膠質細胞更多的功能被逐步發現，表明其除了像巨噬細胞一樣發揮免疫作用外，還會通過直接接觸與神經元細胞交流，參與神經元存活、凋亡、遷移、突觸修剪、甚至神經回路形成等的生理活動[17-19]。正常狀態下小膠質細胞呈分支狀，會利用胞體伸出的長分支不斷運動來監測腦環境，接受胞外信號并對其進行轉導整合，不斷對自身調整以維持腦內穩態，此時也會有一小部分小膠質細胞在有限的時間里顯示吞噬活性來將凋亡的細胞清除。而在受到損傷或感染的情況下，小膠質細胞則會應對損傷分子相關模式(PAMPs)或病原相關分子模式(DAMPs)做出應答，在病灶局部逐步激活向疾病相關小膠質細胞表型轉化，形態上有胞體變大、分支減少且加粗的變化，表現為一種過度增大的或是阿米巴樣的小膠質細胞。此過程取決于特定的病理狀況，不同病理環境下轉化而成的不同小膠質細胞表型發揮的效應可能有較大差異。此時小膠質細胞還會發生活躍的增值，形成小膠質細胞屏障減緩病灶區的擴大，同時吞噬能力也會增強，發揮一定的神經保護作用[20]。

TREM2作為一個具有免疫調節作用，在CNS中只表達于小膠質細胞的受體，能夠通過參與小膠質細胞的吞噬、增值、存活、自噬、能量代謝等方面而發揮作用。在TREM2純合子T66M和W50C錯義突變引起發病的NHD患者中獲取并誘導產生多能干細胞來源的小膠質樣細胞，發現攜帶TREM2突變的小膠質樣細胞的TREM2表達和分泌水平顯著降低，且細胞存活率下降，對凋亡體的吞噬作用受損，顯示TREM2在維持小膠質細胞存活及正常吞噬方面的重要作用[21]。研究發現，在TREM2敲除的5XFAD小鼠模型中，小膠質細胞會產生大量的自噬小泡，在加入環肌酸增加能量儲存后有所減輕，表明在TREM2敲除小鼠中小膠質細胞有能量代謝障礙的發生[22]。也有報道稱，TREM2可能與細胞凋亡也有關聯，在對銅綠假單胞菌所致角膜炎的研究中，研究者發現Trem2-/-小鼠會較正常C57BL/6小鼠病情加重，最終證實此效應是由于TREM2能夠通過抑制caspase-1依賴的細胞凋亡來促進宿主對銅綠假單胞菌的抵抗而產生的[23]。另外，大量研究表明，在TREM2敲除的狀態下，會損傷小膠質細胞在病灶區域附近的增殖激活，從而在數量及效應上使小膠質細胞不能發揮正常的腦保護作用，加重疾病損傷。

3 TREM2與神經系統疾病

研究發現TREM2在諸如阿爾茲海默癥(AD)、帕金森癥(PD)、自閉癥(ASDs)、多發性硬化(MS)、肌萎縮側索硬化癥(ALS)等眾多神經系統疾病中均會表達上調[24]。

3.1AD目前已大約發現30個與AD發病相關的常見基因突變位點，其中載脂蛋白E基因的ε4等位基因突變是目前研究最多最明確的遲發性AD風險因子。此外也發現一些編碼免疫調節作用蛋白基因(譬如，TREM2、CD33)的罕見突變也會增加遲發型AD的發病風險，關于TREM2與AD的關聯研究目前備受關注。運用基因組測序、外顯子組測序及桑格測序法，對1 092名AD患者及1107位正常受試者TREM2遺傳變異性進行分析，發現AD患者中共有22名TREM2等位基因突變者，而對照組中僅有5名，顯示 TREM2突變與AD發病存在著高度相關性。之后的全基因組關聯研究也證實了TREM2的罕見突變會顯著增加遲發型AD的發病風險[25]。另外，在發表于2017年的一篇報道中，用單細胞RNA測序的方法在AD模型中發現了一種具神經保護作用的疾病相關小膠質細胞新表型。他們發現這類新發現的疾病相關小膠質細胞激活過程包括2個階段，在激活的第1階段雖不依賴TREM2，但會增加TREM2信號結合配體相關基因的表達，例如：APOE。而其激活的第2階段則依賴于TREM2信號通路，此階段的細胞中與脂質代謝及吞噬相關的信號通路會表達上調，在TREM2敲除的情況下第2階段激活過程則會發生障礙，暗示了 TREM2對于AD疾病發展晚期階段可能具有重要意義。最為重要的是，這篇報道發現的與AD相關的小膠質細胞新表型所具有的對神經退行性疾病的抑制作用[26]，也顯示了這種疾病相關小膠質細胞作為一種治療遲發型AD手段的可能。

那么TREM2究竟在AD中扮演怎樣的角色呢？TREM2能作為小膠質細胞上Aβ斑塊的受體，在與Aβ結合后負責下游信號的傳導，TREM2完全敲除會導致Aβ誘導分泌的細胞因子及下游信號通路改變，進而使小膠質細胞對病理產物的吞噬作用受損。研究工作也證實，TREM2在清除病理產物上的重要貢獻，他們發現TREM2缺失下會降低運用Aβ抗體結合促進小膠質細胞對Aβ斑塊清除的AD免疫療法療效。在TREM2敲除下會加重5XFAD小鼠模型的Aβ斑塊沉積及神經元丟失狀況。而就針對TREM2部分缺失及完全缺失的差異，通過RNA測序發現TREM2單倍劑量不足與完全缺乏狀態下小膠質細胞轉錄組差異極大，于是隨后觀察了在體情況下Tau蛋白病理模型P301S+小鼠TREM2部分缺失和完全缺失小膠質細胞應對病理損傷的差異，發現對疾病應答的過程中TREM2+/-小鼠比Trem2-/-小鼠的小膠質細胞顯示更強的損傷作用，會加重Tau蛋白病理狀況，且這種效應呈現年齡依賴的趨勢，在老齡鼠中表現顯著。而相比之下，TREM2完全缺乏卻顯示一定的腦保護作用，此組別的小鼠在應對Tau蛋白所致的腦萎縮下側腦室體積會有所減小，研究者猜測這種效應是由于TREM2完全缺失后小膠質細胞增值、激活。或許TREM2突變就好比一個司令部總在發出錯誤指令一樣，會導致比完全癱瘓更為可怕的后果。而由于雜合子突變似乎顯示在遲發型AD發病緣由中占有很大比例，因此單倍劑量不足所致的效應可能更有參考意義。

關于TREM2單個核苷酸多態性(SNPs)與遲發型AD的關聯的研究，以R47H突變最為受關注，其增加AD發病風險的讓步比為5.05，幾乎與APOE4風險因子相當。早前有研究者在體外試驗中發現R47H突變會損傷TREM2與配體的正常結合功能，近年來陸續有報道闡明在體狀態下R47H對AD的作用。在APPPS1-21，R47H突變小鼠中，總TREM2 mRNA的表達水平有明顯下降，斑塊附近的小膠質細胞對沉積的淀粉樣蛋白反應性降低，斑塊周圍小膠質細胞積累減少，且與TREM2敲除組小鼠相比無顯著差異[27]。而在另一篇運用人源化淀粉樣蛋白病理模型的報道中也觀察到同樣的效應，作者對比了5XFAD；R47H小鼠、5XFAD；Trem2-/-小鼠和普通突變的5XFAD小鼠在對于淀粉樣斑塊積累過程中的應答差異，發現 R47H突變會損壞病理性斑塊誘導下所致的小膠質細胞在斑塊附近的增殖激活，效應與Trem2-/-；5XFAD組別亦無顯著差別，而普通突變組小膠質細胞在斑塊附近的增殖效應卻并沒有受到影響[28]。總的來說，從研究結果可以推測R47H突變增加AD患病風險的緣由可能是R47H突變下會顯著降低TREM2與相關配體結合，從而可能損害到小膠質細胞的正常功能，使其不能及時對某些風險信號做出應答以維持腦內穩態。而當疾病開始發生時，小膠質細胞也無力應答病理斑塊做出正常應答來減緩疾病進程的發展。

3.2 其他相關疾病雖研究的聚焦點主要落在TREM2單個核苷酸多態性與AD間的關聯上，TREM2突變與其他一些神經退行性疾病(諸如Nasu-Hakola、額顳葉癡呆、ALS)的聯系也不容忽視。Nasu-Hakola(NHD)也稱脂膜樣多囊性骨發育不良，是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，該疾病的主要臨床表現有發展迅速的癡呆癥狀及僅限于手腕和腳踝的骨囊腫癥狀。遺傳學研究表明這一疾病與TREM2及其接頭蛋白DAP12的失活突變相關。有研究者發現TREM2缺失下患者的破骨細胞分化會受到抑制，從而導致骨吸收活性下降，表明這可能就是NHD患者會發生反復骨折的原因。ALS也與TREM2的突變顯示一定關聯，從美國ALS診所中招募到923名ALS受試者并以1 854名非西班牙裔白人作正常對照。他們對樣本的TREM2的R47H變異體進行基因分型。結果發現與對照組相比，攜帶R47H突變的患者在ALS患者中更為普遍，讓步比為2.4，表明R47H同時也為ALS的一個顯著風險因子。另外，也有研究者表明TREM2突變也對自然衰老下小膠質細胞的改變及神經元丟失的發生有一定貢獻[29]。

4 TREM2的變異體

TREM2突變雖然罕見，但發現的類型很多。目前與AD相關的TREM2突變已發現有46種，其中罕見變異體R47H(rs75932628)，編碼蛋白鏈上第47位精氨酸變為組氨酸的突變，被認為與遲發型AD發病高度相關。在對歐洲和北美人群的調查中發現R47H能夠增加AD的發病風險到兩到三倍。一般認為，R47H突變下損傷TREM2與其陰離子配體的正常結合是導致某些疾病發生的分子學機制。通過對R47H及正常TREM2對照組胞外結構域的晶體結構研究發現Arg47對于維持TREM2互補決定區2(CDR2)環的結構特征及穩定其與配體相互作用的構象上發揮重要作用。這或許也解釋了為何在眾多TREM2突變體中，R47H突變顯示更顯著后果的原因。而對于其他AD相關TREM2的變異體，雖研究相對較少，但仍顯示出不可忽視的效應。研究發現位于胞外結構域上的錯義突變p.T66M及p.Y38C，除明顯增加TREM2蛋白的錯誤折疊外，還會導致未成熟的TREM2蛋白滯留于內質網以致使TREM2表達下降，影響到小膠質細胞的正常功能，包括依賴于TREM2的吞噬功能。而α-分泌酶的切割位點，157位上編碼組氨酸的突變p.H157Y則會增強TREM2裂解導致TREM2表達缺失。另有報道稱在對p.R62H和p.R62C兩種突變體的體外研究顯示，此兩種突變下會對磷脂的應答下降，而另兩種突變p.T96K和p.D87N雖顯示會與磷脂的結合增強，但卻和前兩種突變產生相似的效應。此外，研究者也發現了具有神經保護作用的TREM2突變，通過全基因組關聯研究對AD患者顳葉皮層(n=399)及小腦(n=374)基因表達分析，發現一種TREM2 突變(命名為rs9357347-C)，可以通過提高TREM2及TREML1的表達水平來降低AD的發病風險，發揮神經保護作用。而這些及其他罕見的TREM2變異體在體內條件下的影響作用有待研究。其他與AD相關的TREM2突變有：R62H、R52H、R136W、R136Q、H157Y、W191X、E202D、H215Q、T223I[27]。對于這些TREM2低頻的突變在神經系統疾病中發揮的作用，雖建立基因型-表型的關聯研究較為困難，但仍具有重要的意義，此研究工作蘊藏著潛在價值可為臨床上治療疾病提供新的思路和手段。

5 總結

血腦屏障作用下各類循環中的免疫細胞難以進入腦實質，盡管研究表明激活的T淋巴細胞可以通過變形的方式穿過內皮組織進入腦內，但小膠質細胞仍舊是中樞神經系統應對不利環境下的主要免疫細胞。因此，維持小膠質細胞的健康狀態應該是預防及治療腦疾病的關鍵著手點。TREM2在調控小膠質細胞的生命活動方面具有重要意義，可以通過眾多途徑調控小膠質細胞的各類功能，其作用甚至可以跨到另一個維度上，對其他系統(如循環系統)產生某些影響。雖然有眾多謎團仍待解開，但可以確定的是，TREM2異常狀態下對于小膠質細胞乃至中樞神經系統具有相當不利的影響，而對于TREM2正常結構的維持也有望成為一項有效的治療手段。