紅景天苷對永久性大腦中動脈閉塞模型大鼠的神經保護作用

劉俊杰，楊澤霖，唐宇恒，黃 鑫，孫春曉，許阿娟，賴文芳，洪桂祝

(福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122)

腦卒中，俗稱腦中風，是一種突然起病的腦血液循環障礙性疾病，也是腦血管疾病最嚴重的并發癥。缺血性卒中患者大約占全部腦中風患者的85%，主要是由于腦部血流堵塞，導致供氧不足，線粒體功能障礙和最后神經細胞死亡而引起的疾病[1]。同時，因其具有發病迅猛、治療窗短缺、病情復雜、高致殘率以及高致死率等特點，為家庭和社會帶來嚴重的負擔[2]。

紅景天(RhodioldroseaL.)在我國具有悠久的藥用歷史，是生長于海拔3500米以上的天然植物。根據中國藥典2015版描述，紅景天具有“益氣活血，通脈平喘”的藥理作用[3]，數種抗心肌缺血的中成藥將紅景天作為主成分。紅景天苷(salidroside，Sal)是紅景天的主要有效成分，也是其藥用基礎物質的標志。課題組前期研究發現，Sal能夠降低暫時性大腦中動脈閉塞模型(temporary middle cerebral artery occlusion，tMCAO)大鼠的腦梗死體積，且具有神經保護作用[3-6]。課題組將根據最新國際腦卒中治療學術產業圓桌會議關于臨床前研究的建議，需要選擇兩種及以上動物模型，進行藥效評價指標[7]。本文重點研究Sal對永久性大腦中動脈閉塞模型(permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO)大鼠的作用，探討紅景天苷神經保護的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物SPF級健康成年♂ SD大鼠60只，體質量(260～280) g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司(合格證號：2015000509563，許可證號：SCXK(滬)2015-0002)，由福建中醫藥大學實驗動物中心飼養，許可證號：SYXK(閩)2015-0005。

1.2 藥品與主要試劑紅景天苷(純度≥98%)由福建中醫藥大學藥學院提供。TUNEL凋亡檢測試劑盒(貨號：G3250)購自Promega公司，NeuN 抗體(貨號:ab104224)購自英國Abcam公司，NGF 抗體(sc-365944)購自Santa Cruz公司，Cleaved caspase-3抗體(9661s)、Caspase-3抗體(9662s)均購自Cell Signaling Technology公司，DAPI染色液(貨號：C1006)，鼠抗(貨號：31430)，兔抗(貨號：31460)均購自Thermo Scientific公司，β-actin抗體(貨號AF0003：)、超敏ECL化學發光試劑盒(貨號：P0012A)抗熒光淬滅封片液(貨號：P0126)均購自碧云天生物技術有限公司；PBS磷酸鹽緩沖液粉末(貨號：17032701)，檸檬酸鹽緩沖液粉末(貨號：17021404)均購自邁新生物技術有限公司；尼氏染色液(貨號：DK0022)購自北京雷根生物技術有限公司。

1.3 實驗儀器核磁共振成像儀(Bruker公司，型號：7.0T)，ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(美國Biorad公司)，3600AAA尼龍線栓(廣州佳靈生物技術有限公司)，激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)，基礎電泳儀電源(美國Bio-Rad公司)；石蠟切片機(Thermo Fisher公司，型號：HM325)；生物組織石蠟包埋機(Thermo Fisher公司，型號：YB-6LF)。

2 方法

2.1 pMCAO模型大鼠制作采用線栓法制備pMCAO模型。SD大鼠采用2%戊巴比妥鈉(2 mL·kg-1)腹腔注射麻醉后，沿頸部中線切開，暴露左側的頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，用醫用縫合線分別對頸總動脈和頸外動脈進行結扎，用動脈夾夾閉頸內動脈，在頸總動脈血管壁上剪一小口，將備好的線栓自頸總動脈切口插入，沿著頸總動脈向頸內動脈緩慢引入，待上行至大腦中動脈起始端即可停止，線栓固定后，按要求消毒后縫合切口即可。假手術組除不插入線栓外其余操作同模型組。待大鼠清醒對其進行神經功能評分，參照Longa法[8]進行神經功能功能缺損評價，在雙盲條件下進行大鼠pMCAO模型鑒定，神經功能缺損評分在2～3分視為模型成功。

2.2 實驗動物分組和給藥健康成年♂ SD大鼠60只，適應性喂養1周，隨機分為假手術組(sham組)20只和造模組40只；造模組大鼠采用線栓法制作pMCAO模型，造模成功后，抽簽法隨機分為pMCAO模型對照組(pMCAO組)20只、紅景天苷給藥組(pMCAO+Sal組)20只。大鼠造模后正常飼養，評分后每天按時對sham組和pMCAO組大鼠按體質量腹腔注射0.9%生理鹽水(10 mL·kg-1·d-1)，pMCAO+Sal組按體質量組腹腔注射紅景天苷(50 mg·kg-1·d-1)[6]，連續給藥6 d。末次給藥后對各組存活的大鼠進行神經功能評分并進行MRI腦部掃描，掃描結束后將其麻醉處死后取材。

2.3 MRI大鼠腦部核磁共振成像掃描將待掃描的大鼠放入麻醉盒，通入麻醉氣體異氟烷將其麻醉后將其轉移至線圈內的支架軌道上固定并保持鼻腔一定流量的異氟烷的持續通入，腹部置一循環水加熱墊以保持掃描期間的正常體溫。顱腦線圈固定于大鼠頭部，設置序列參數進行掃描，保存掃描數據待分析。T2序列參數 Repetition time (TR)=2 738.308 ms,Echo time (TE) =33.00 ms,Echo spacing= 11.000 ms,Slice thickness (ST) =0.8 mm,Slices=24,Matrix size=256×256,Field of view (FOV) =30.00×30.00,Number of excitation (NEX)= 4.0。采用盲法對收集的各組T2成像數據通過圖像處理軟件ImageJ進行梗死體積計算。

2.4 Nissl染色法檢測尼氏體的表達保存的腦組織進行石蠟包埋，蠟塊5 μm厚度切片，經過脫蠟復水，在56 ℃溫箱內于含有焦油紫的染缸中浸染30 min；酒精燈上加溫至切片冒泡約10 min；去離子水洗去染液，尼氏分化液分化1～3 min；無水乙醇脫水；二甲苯透明；晾干后用中性樹脂封片，在鏡下觀察結果并拍照留存，用圖像分析軟件Motic Med 6.0測定梗死體積。

2.5 免疫組織化學染色測定腦組織中TUNEL表達保存的腦組織石蠟包埋，厚5 μm切片，經脫蠟復水，抗原修復后，0.9%NaCl溶液液里浸泡5 min；PBS溶液浸泡5 min；4%多聚甲醇固定15 min；PBS溶液浸泡2次，每次5 min；滴加稀釋的蛋白酶Κ工作液室溫孵育8～10 min；PBS溶液浸泡5 min；4%多聚甲醇固定5 min；PBS溶液浸泡5 min，2次；滴加平衡酚沖液室溫平衡5～10 min；滴加TdT酶反應液，37 ℃濕盒中避光孵育60 min；浸潤2×SSC溶液，室溫避光孵育15 min終止反應；PBS溶液浸泡3次，每次5min；DAPI室溫避光染核8 min；PBS溶液浸泡3次，每次5 min；滴加抗淬滅劑后封片，使用熒光倒置顯微鏡觀察、記錄結果。各組隨機選取5個視野計數細胞總數和陽性表達細胞數，陽性細胞百分比/%=陽性表達細胞數/總細胞×100%。

2.6 Western blot分析腦組織中蛋白的表達水平提取大鼠缺血側大腦總蛋白，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白；轉移凝膠上蛋白至PVDF膜上；5%BSA溶液室溫封閉2 h；稀釋后的一抗4 ℃搖床孵育孵育過夜；TBST洗滌3次，每次10 min；稀釋1 000倍的二抗溶液室溫孵育2 h；TBST洗滌3次，每次10 min；添加加ECL顯色劑，顯影。用凝膠圖像處理系統Image Lab 6.0分析目標條帶的灰度值，分別計算各組目的蛋白與內參β-actin灰度值的比值，并統計比較各組之間的差異。

3 結果

3.1 紅景天苷對pMCAO大鼠腦梗死體積的影響與Sham組比較，pMCAO組大鼠腦組織缺血側腦梗死體積顯著增加(P<0.01)。與pMCAO組相比，Sal連續給藥6 d，能降低pMCAO大鼠缺血側腦梗死體積(Fig 1)，差異具有統計學意義(P<0.01)。

Fig 1 Effect of salidroside on cerebral infarct volume in pMCAO rats n=3)A：Sham;B:pMCAO;C:pMCAO +Sal；##P<0.01 vs sham,**P<0.01 vs pMCAO

3.2 紅景天苷增加pMCAO模型大鼠缺血側Nissl陽性細胞數與Sham組比較，Nissl染色鏡檢結果顯示，pMCAO模型大鼠Nissl陽性細胞(即完整神經元)數目減少，經Sal作用后，Nissl陽性細胞數顯著增多，且差異具有統計學意義(P<0.01)(Fig 2)。

Fig 2 Number of Nissl-positive cells on ischemic side of pMCAO model rats increased by salidroside n=3)A：Sham;B:pMCAO;C:pMCAO +Sal；##P<0.01 vs sham,**P<0.01 vs pMCAO

3.3 紅景天苷能夠降低pMCAO模型大鼠細胞凋亡數目，降低Cleaved caspase-3的蛋白水平與Sham組相比，TUNEL染色顯示，pMCAO模型大鼠皮質細胞凋亡數目增多，經Sal連續給藥6d后，皮質細胞凋亡數目顯著減少，且差異具有統計學意義(P<0.01)(Fig 3)；與Sham組相比，Western blot結果表明，pMCAO模型大鼠缺血側Cleaved caspase-3的蛋白表達明顯升高(P<0.01)，經Sal連續給藥6 d后，Cleaved caspase-3的蛋白表達降低(P<0.01)，但對總的Caspase-3的表達沒有影響(Fig 4)。

Fig 3 Number of apoptotic cells in pMCAO model rats reduced by salidroside n=3)##P<0.01 vs sham,**P<0.01 vs pMCAO

Fig 4 Cleaved caspase-3 protein levels in ischemic side of pMCAO model rats reduced by salidroside n=3)##P<0.01 vs sham,**P<0.01 vs pMCAO

3.4 紅景天苷對pMCAO模型大鼠缺血側神經細胞標記物NeuN及神經營養因子NGF的影響與Sham組比較，Western blot結果表明，pMCAO模型大鼠缺血側神經細胞標記物NeuN蛋白表達降低(P<0.05)，經Sal連續給藥6 d后，能改善大鼠腦組織缺血側神經細胞標記物NeuN蛋白表達，且差異有顯著性(P<0.05)。同時，與Sham組比較，pMCAO模型大鼠缺血側腦組織神經營養因子家族成員NGF的蛋白表達明顯降低(P<0.01)，經Sal連續給藥6 d后，能逆轉腦組織中NGF的蛋白表達，且差異具有顯著性(P<0.05),見Fig 5。

Fig 5 Effect of salidroside on neuronal marker NeuN and neurotrophic factor NGF in ischemic side of #P<0.05,##P<0.01 vs sham,*P<0.05 vs pMCAO

4 討論

中風始終是影響著人類健康最致命的疾病之一。在臨床前的實驗研究中常采用全腦缺血或局灶性腦缺血動物模型模擬臨床上遇到的中風類型[9]。局灶性腦缺血是臨床上最為常見的病例，故大多數實驗研究中采用大腦中動脈閉塞模型模擬該疾病，大腦中動脈閉塞模型又分為短暫性大腦中動脈閉塞模型(tMCAO)和永久性大腦中動脈閉塞模型(pMCAO)[10]。課題組前期研究發現，在tMCAO模型中，Sal不僅具有良好的抗炎抗凋亡的神經保護作用，并且具備更優的治療時間窗。根據最新國際腦卒中治療學術會議，關于臨床前研究的建議，需要選擇多模型進行藥效評價指標[7]。本實驗動物造模采取研究腦缺血經典模型之一的pMCAO模型進行試驗。使用線栓法制造模型后，大鼠表現出行走時原地轉圈或向病灶對側跌倒，自發行走困難，意識功能受損，經Sal連續給藥6 d后，大鼠存活率得以改善，MRI檢測發現，Sal能明顯減少pMCAO模型大鼠腦梗死體積。尼氏體是神經元特征性的結構之一，主要功能是合成蛋白質，為神經活動所必需。尼氏體數量的多少和形態特征可以反映出神經元生長發育、物質轉運及其功能活動正常與否[6]。實驗發現pMCAO模型大鼠Nissl陽性細胞數目減少，經Sal作用后，能夠有效抑制尼氏體損傷，起到神經保護作用。

腦缺血可以激活各種細胞死亡程序，例如壞死，凋亡或自噬相關細胞死亡，細胞凋亡被認為是腦缺血損傷的關鍵事件[10]。本研究通過TUNEL法標記凋亡細胞，發現pMCAO模型大鼠TUNEL陽性細胞數目增多，即細胞凋亡增加，經Sal作用后，TUNEL陽性細胞數目明顯減少，表明Sal具有抑制神經細胞凋亡的作用。凋亡性細胞死亡由定型生化途徑組成，涉及不同信號分子和caspase蛋白酶的激活。在大鼠中風或創傷性腦損傷后，活化的Caspase-3表達增加，即酶切以后的Caspase-3上調與健康神經膠質細胞的數量降低提示發生了細胞凋亡[11]，這與我們的結果吻合。經Sal連續治療6 d以后，能夠減少pMCAO模型大鼠缺血側Cleaved caspase-3的蛋白水平，但對總Caspase-3的的表達水平沒有影響，表明Sal能抑制與Caspase-3相關的神經細胞凋亡。腦內促進神經生長因子與軸突的生長密切相關，神經元的存活及正常功能的維持依賴于神經營養因子，而NGF是神經營養因子家族中的重要成員[12]，此外，增加的NGF表達可能有助于在急性腦損傷和中風早期觀察到的神經炎癥誘導的神經保護作用[13]。本研究結果表明，pMCAO模型大鼠缺血側腦組織NGF的蛋白表達明顯降低，同時，大鼠腦組織缺血側神經細胞標記物NeuN[14]表達量也明顯下降。經Sal連續治療6 d以后，能夠改善pMCAO模型大鼠腦組織缺血側NeuN及NGF蛋白的表達，表明Sal對pMCAO模型大鼠具有神經保護作用，此作用與促進NGF蛋白的表達，進而提升神經細胞存活量有關。

綜上，Sal通過下調Cleaved caspase-3的蛋白水平，促進NGF蛋白表達，進而改善神經細胞存活的的微環境，從而減輕pMCAO模型大鼠的腦梗死體積，改善神經細胞損傷，發揮神經保護的作用。該研究為Sal的臨床前研究提供依據。