早老素Ps1突變基因對阿爾茨海默病模型鼠表觀有效性的影響

胡沿每，劉子重，郭美娜，馬思飛，翟鴻儒，宋黃戎，蘇令通，薛欽洋，王 琪，王 佳，張維寧

(江蘇大學醫學院生物化學檢驗教研室，江蘇 鎮江 212013)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)[1]是一種以認知障礙、進行性記憶衰退為特征的神經系統退行性疾病。AD患者主要表現為記憶力、語言、認知、問題解決能力下降，行為改變等。淀粉樣蛋白斑(amyloid-β，Aβ)是AD主要的病理學特征[2]。越來越多的證據[3-4]表明，Aβ累積在大腦形成斑塊，導致神經元死亡是AD發病機制中的關鍵啟動因素。

大量文獻采用App/Ps1雙轉基因小鼠B6C3-Tg(APPswePSEN1dE9)/Nju作為阿爾茨海默病的模型動物[5-6]，該模型鼠基因型中，含有人類早老素序列Ps1-dE9及人類淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)基因序列APPswe融合體，這兩個基因的表達都由小鼠朊病毒蛋白啟動子啟動。人類早老素基因的Ps1-dE9突變是該基因的第九個外顯子缺失產生的，Wanngren等[7]研究發現，Ps1蛋白可以參與細胞的保護功能，而Ps1基因突變可使γ-分泌酶活性增強從而促進Aβ42的過度合成，加速AD淀粉樣蛋白沉淀，導致早發性老年癡呆癥。Ps1基因對小鼠腦發育至關重要，Elder等[8]研究報道Ps1基因對正常小鼠腦內神經元，神經干細胞生長起保護作用。App/Ps1雙轉基因小鼠腦內發現人類早老素蛋白增加并替代了小鼠內源性蛋白，其腦勻漿中還檢測到了人源淀粉樣前體蛋白[9]。盡管突變的衰老基因ps1-dE9的引入能夠更好地詮釋阿爾茨海默病模型鼠的機理有效性，然而Ps1對該模型動物的表觀有效性的影響國內外尚未見任何報道，因此，當前的研究通過對比App單轉基因小鼠及App/Ps1雙轉基因小鼠在認知、學習、記憶功能及自主活動能力、情緒方面的異同，評價衰老基因Ps1在阿爾茨海默病基因模型鼠研究中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 繁殖與飼養SPF清潔級轉基因小鼠App/Ps1B6C3-Tg(APPswePSEN1dE9)/NjuAPPswePS EN1d E9(App/Ps1)購于南京生物醫藥研究院(許可證編號：SCXK (蘇)2018-0008)，品系背景為B6C3F1，App/Ps1雙轉基因小鼠雌鼠6只，雄鼠2只。經隔離觀察未見異常后進入飼養區，嚴格按照SPF動物管理相關規定執行。繁育方式：適應1周后，育齡期App/Ps1雙轉基因小鼠按照雄 ∶雌鼠1 ∶3配對，于20 ∶00 pm合籠，d 2 8 ∶00 am對雌鼠進行陰道栓檢查(雌鼠孕齡為19～21 d)，繁育后獲得的60只子代小鼠，存活57只，即存活率為95%。經PCR鑒定獲得兩種基因型小鼠：單轉基因小鼠App(n=19，獲得率=33.3%)與雙轉基因型小鼠App/Ps1(n=38，獲得率=66.7%)，37只用于繁育及保種，20只用于后續的行為學實驗。

1.2 試劑與儀器瓊脂糖(批號：1110GR500，德國BioFroxx公司)，PCR儀(美國Applied Biosystems公司)，凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)，基因組DNA提取試劑盒(碧云天生物技術公司)，行為學追蹤記錄軟件(Ethovision8.5,Noldus，荷蘭)。

1.3 小鼠基因型鑒定提取出生后6～7 d的小鼠腳趾基因組DNA：(1)乙醇消毒小鼠腳趾，取小鼠腳趾(按1～10的順序)放入1.5 mL EP管中，適當離心30 s使其沉于管底。(2)加入30 μL裂解液(20% Tween-20 5 mL，1mol/L KCl 10 mL，1mol/L MgCl2 0.5 mL，1mol/L pH 8.0 Tris-HCl 3 mL，雙蒸水181.5 mL至總裂解液200 mL，分裝成30 μL/EP管)，用前30 μL/EP管加入200 mg·L-1蛋白酶K 3 μL;(3)55 ℃水浴消化3～5 h，4 ℃12 000 r·min-1離心2 min，95 ℃取上清液，95 ℃水浴 15 min 以滅活蛋白酶 K，4 ℃ 12 000 r·min-1離心2 min，所獲得的上清中DNA用于PCR模板，-20 ℃保存，用于基因型鑒定。以提取的DNA為模板進行擴增，擴增體系：20 μL。采用兩對引物1597/1598(App)和1644/1645(Ps1)進行小鼠基因型鑒定。引物1597和1598的序列分別為：5′-GACTGACCACTCGACC AGGTTCTG-3′和5′-CTTGTAAGTTGGATTCTCATATC CG-3′。引物1644和1645的序列分別為5′-AAT AGAGAACGGCAGGAGCA-3′，5′-GCCATGAGGGCAC TAATCAT-3′。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60～65 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，72 ℃ 5 min，35個循環；10 ℃保存。PCR產物行2%瓊脂糖凝膠電泳。電泳完成后用Bio Rad凝膠電泳成像儀照相。

1.4 實驗分組實驗分為兩組：App/Ps1雙轉基因小鼠組及App單轉基因小鼠組(6月齡，10只/組)。據前期報道[10]，App/Ps1雙轉基因小鼠生長至6月齡，Aβ開始在腦內沉積。故此，當前的實驗選取6月齡的小鼠作為研究對象。本研究中對該基因型的2月齡小鼠和6月齡小鼠腦內Aβ沉積狀況做了免疫組化對比，證明App/Ps1雙轉基因模型鼠的模型建立成功。見Fig 1。

Fig 1 Immunohistochemical comparison of Aβ-amyloid in brain of App/Ps1 double transgenic mice at 2 and 6 months

1.5 行為學實驗行為學實驗按照以下的順序進行：曠場實驗，高架十字迷宮實驗，新物體識/新位置識別實驗，Morris水迷宮實驗。每只小鼠實驗完畢后，用75%乙醇清潔實驗用具。

1.5.1曠場實驗 本實驗主要用于測試小鼠的自主活動行為和探索行為。通過分析軟件設置一個大小約長(30 cm) × 寬(30 cm)區域為曠場箱的中央區域，中央區域的四周離曠場箱邊緣10 cm。在其上方垂直置有攝像頭，可記錄小鼠的活動軌跡。通過EthoVision 8.5軟件分析小鼠在30 min內活動的總距離及在中央區域活動的距離、頻率和速度。

1.5.2高架十字迷宮實驗 本實驗是利用動物對敞開臂的探究和恐懼的矛盾行為來考察動物的焦慮狀態。開放臂和閉合臂長(30 cm) × 寬(10 cm) × 高(20 cm)。實驗開始前將小鼠放在中央平臺記錄5 min內小鼠進入開放臂和閉合臂的次數和時間，統計分析小鼠進入開放臂頻率百分比與時間百分比。

1.5.3新物體/位置識別實驗 新物體識別實驗(Fig 2)步驟如下：①將實驗小鼠放進一個長(40 cm) × 寬(40 cm) × 高(40 cm)空開箱內，允許其自由探索10 min以適應環境，然后將其放回原鼠籠休息。②把兩個不同的物體A、B放入由分析軟件標記的開箱內固定兩位置，讓小鼠在箱內探索5 min，再將其放回原籠休息5 min。③將開箱內的的A物體換成新的C物體，B物體保持原位不動，將小鼠再次放入箱中探5 min，通過自動分析軟Etho-Vision 8.5記錄實驗小鼠在新物體C周圍活動的時間、頻率比，判斷小鼠認知能力。新位置識別實驗(Fig 2)是用來判斷實驗小鼠位置識別能力。實驗步驟前兩步與新物體識別實驗步驟一致，第三步則是把物體B由原來位置換到另一個不同位置，將小鼠再次放入箱中探索5 min，通過自動分析軟件EthoVision 8.5 記錄實驗小鼠在新位置周圍活動的時間、頻率比。

Fig 2 Schematic diagram for novel object/place recognition test

1.5.4Morris水迷宮實驗 水迷宮為直徑(120 cm)，高(50 cm)帶有恒溫加熱棒的圓形游泳池，將泳池等分為4個象限，泳池內壁標上東南西北4個入水點，池水溫度為(20±5) ℃，平臺直徑10 cm。本實驗進行12 d，實驗前1 d為視覺測試訓練，逃生平臺露出水面1 cm。平臺按西北-東北-東南-西南順序移動，小鼠從平臺的對側象限放入泳池中(順序為：東南-西南-西北-東北)每天訓練4次，每次60 s，找到平臺后在其上休息10 s，若超過60 s未找到平臺，由實驗者將小鼠引導至平臺，休息10 s。d 1～6為獲得性訓練階段，將平臺放置于西北象限中央并低于水面1 cm，每天訓練4次，訓練方法同上。d 7為探查測試，將平臺撤除，測定小鼠在目標象限的對側象限放入后尋找目標象限平臺的次數和小鼠在目標象限的時間，以此作為空間記憶檢測指標。d 8～11將平臺放在原先平臺對面位置，為對位訓練階段，用來測定小鼠的學習記憶，方法與獲得性訓練相同。每天訓練4次，記錄尋找到平臺的時間、距離及速度。d 12進行對位探查測試。方法與探查測試類似，記錄小鼠60 s內在目標象限的時間和次數。

2 結果

2.1 App/Ps1雙轉基因小鼠PCR鑒定結果PCR鑒定引物為1597和1598(App)以及1644和1645(ps1)結果見Fig 3，擴增出350 bp和608 bp條帶的為App/ps1小鼠，如泳道1、2、3、5、6、7、8；只擴增出350 bp條帶的為單純App基因型的小鼠，如泳道4。

Fig 3 Genotype identification of App/Ps1 and App mice

2.2 曠場實驗結果App/Ps1雙轉基因小鼠與App單轉基因小鼠活動距離差異有顯著性(Fig 4A,F1,14=5.742,P=0.031 1)，與App/Ps1雙轉基因小鼠(6 090.50±2 410.91)相比，App單轉基因小鼠(8 461.48±1 420.91)活動距離增加；App/Ps1雙轉基因小鼠與App單轉基因小鼠兩者在中心區域的活動距離差異有顯著性(Fig 4B,F1,14=11.999,P=0.003 8)，與App/Ps1雙轉基因小鼠(498.25 ± 200.94)相比，App單轉基因小鼠(1 364.31±650.25)在中心區域活動距離增加；此外，App/Ps1雙轉基因小鼠與App單轉基因小鼠兩者在進入中心區域的頻率百分比差異也有顯著性(Fig 4C,F1,14=11.571,P=0.004 3)，與App/Ps1雙轉基因小鼠(26.75±16.82)相比，App單轉基因小鼠(71.37±21.36)進入中心區域頻率百分比增加；App/Ps1雙轉基因小鼠與App單轉基因小鼠兩者的運動速度有顯著差異(Fig 4D,F1,14=10.086,P=0.006 7)，與App/Ps1雙轉基因小鼠(4.37±2.18)相比，App單轉基因小鼠(8.21±2.11)運動速度增加。

Fig 4 Knock in of Ps1 gene accelerated hypofunction of AD mice in OFT n=2)A:Total distance moved;B:Distance moved in the central area;C:Frequency in central area%=[(Central area/(central area+Peripheral area)×100%].(D) Velocity.Values were expressed as *P<0.05,**P<0.01 vs App/Ps1 genotype mice.

2.3 高架十字迷宮實驗結果App/Ps1雙轉基因小鼠與App單轉基因小鼠進入開放臂頻率百分比差異有顯著性(Fig 5A,F1,18=14.735,P=0.001 2)，與App/Ps1雙轉基因小鼠(39.71±6.14)相比，App單轉基因小鼠(53.46±9.52)進入開放臂頻率百分比增多；App/Ps1雙轉基因小鼠與App單轉基因小鼠在開放臂時間百分比差異也有顯著性(Fig 5B,F1,18=13.847,P=0.001 6)，與App/Ps1雙轉基因小鼠(26.83±1.75)相比，App單轉基因小鼠(35.16±6.85)在開放臂時間百分比增多。

Fig 5 Knock in of Ps1 gene induced anxiety-like behavior of AD mice in EPMT n=2)A:Frequency in open arm/%=[(Open arm/(Open arm+Closed arm)×100%];B:Duration in open arm/%=[(Open arm/(Open arm + Closed arm)×100%].Values were expressed as **P<0.01 vs App/Ps1 genotype mice.

2.4 新物體/新位置識別實驗結果One-way ANOVA結果顯示：App/Ps1雙轉基因小鼠與App單轉基因小鼠對于新物體的識別指數百分比有顯著差異(Fig 6A,F1,14=24.086,P=0.000 2)，與App/Ps1雙轉基因小鼠(-7.23±1.19)相比，App單轉基因小鼠(-10.38±1.36)在新物體測試中的識別指數百分比增高；App/Ps1雙轉基因小鼠與App單轉基因小鼠兩者對于新位置的識別指數百分比差異有顯著性(Fig 6B,F1,14=21.353,P=0.000 4)，與App/Ps1雙轉基因小鼠(-26.87±4.72)相比，App單轉基因小鼠(-40.15±6.61)在新位置測試中的識別指數百分比增高。

Fig 6 Knock in of Ps1 gene accelerated cognitive dysfunction of AD mice in NORT and NPRT n=2)Recognition index (RI) uses the difference in recognition Duration (D) for novel (DN) and familiar object/place (DF),but then dividing this difference value by the total amount of exploration of the novel and familiar object RI/%=(DN-DF)/(DN+DF) ×100%].(A) Recognition index in the NORT%.(B) Recognition index in the NPRT%.Values were expressed as vs App/Ps1 genotype mice.

2.5 Morris水迷宮實驗結果本實驗流程(Fig 7A)包括d 1～6獲得性訓練、探查測試1(d 7)、d 8～11對位訓練及探查測試2(d 12)。

2.5.1d 1～6獲得性訓練 Repeated ANOVA結果顯示：App/Ps1雙轉基因小鼠與App單轉基因小鼠兩者找到平臺的距離差異有顯著性(Fig 7B,F1,18=34.866,P<0.000 1)，與App/Ps1雙轉基因小鼠(872.97±89.15)相比，App單轉基因小鼠(661.73±69.64)在獲得性訓練測試中找到平臺的距離(到達平臺距離)顯著減少；App/Ps1雙轉基因小鼠與App單轉基因小鼠兩者找到平臺時間也差異有顯著性(Fig 7C,F1,18=53.695,P<0.000 1)，與App/Ps1雙轉基因小鼠(34.69±4.18)相比，App單轉基因小鼠(22.14±3.45)在獲得性訓練測試中找到平臺的時間減少；此外，App/Ps1雙轉基因小鼠與App單轉基因小鼠兩者游泳速度差異也有顯著性(Fig 7D,F1,18= 15.806,P=0.000 9)；與App/Ps1雙轉基因小鼠(15.09±1.86)相比，App單轉基因小鼠(17.80±1.08)在獲得性訓練測試中游泳速度增加。

2.5.2探查測試1(d 7) One-way ANOVA結果顯示：App/Ps1雙轉基因小鼠與App單轉基因小鼠兩者目標象限(NW)中停留的距離百分比差異有顯著性(Fig 7E,F1,18=8.89,P=0.008)；與App/Ps1雙轉基因小鼠(23.83±5.02)相比，App單轉基因小鼠(34.81±10.49)NW象限中的距離百分比增高；App/Ps1雙轉基因小鼠與App單轉基因小鼠兩者NW象限中停留時間百分比差異有顯著性(Fig 7F,F1,18=4.552,P=0.046 9)，與App/Ps1雙轉基因小鼠(27.69±4.47)相比，App單轉基因小鼠(33.20±6.83)NW象限中停留的時間百分比增高。

2.5.38～11d反向學習訓練 Repeated ANOVA結果顯示：App/Ps1雙轉基因小鼠與App單轉基因小鼠兩者尋找到平臺的距離差異有顯著性(Fig 7B,F1,18=18.38,P=0.000 4)，與App/Ps1雙轉基因小鼠(513.68±68.49)相比，App單轉基因小鼠(408.38±39.35)在對位訓練測試中的尋找到平臺的距離減少；App/Ps1雙轉基因小鼠與App單轉基因小鼠兩者尋找到平臺的時間差異也有顯著性(Fig 7C,F1,18=39.028,P<0.000 1)，與App/Ps1雙轉基因小鼠(38.04±6.96)相比，App單轉基因小鼠(23.35±2.59)在對位訓練測試中尋找到平臺的時間顯著減少；此外，App/Ps1雙轉基因小鼠與App單轉基因小鼠兩者游泳速度差異也有顯著性(Fig 7D,F1,18=58.246,P<0.000 1)，與App/Ps1雙轉基因小鼠(13.86±1.28)相比，App單轉基因小鼠(17.72±0.94)在對位訓練測試中游泳速度增加。

2.5.4d 12探查測試2 One-way ANOVA結果顯示：App/Ps1雙轉基因小鼠與App單轉基因小鼠在目標象限(SE)中停留的距離百分比差異有顯著性(Fig 7G,F1,18=11.65,P=0.003 1)，對比兩者在SE象限中停留的距離百分比發現，與App/Ps1雙轉基因小鼠(21.42±3.41)相比，App單轉基因小鼠(28.32±5.40)在SE象限中的距離百分比增加；App/Ps1雙轉基因小鼠與App單轉基因小鼠兩者在SE象限中停留時間百分比差異有顯著性(Fig 7H,F1,18=8.193,P=0.010 4)，與App/Ps1雙轉基因小鼠(25.21±3.91)相比，App單轉基因小鼠(31.87±6.23)在SE象限中停留的時間百分比增加。

Fig 7 Knock in of Ps1 gene accelerated spatial cognitive dysfunction of AD mice in MWMTA：showed the training schedule in the WM；B～D：exhibited the path length,escape latency and velocity respectively for animal to reach a hidden platform during the acquisition and reversal phase in means of 4 trials within days.The distance；E，F：spent in target zone of the water maze pool during the probe test 1 (E) was showed by bar graph.Also,the distance (G) and duration (H) spent in target zone of the water maze pool during the probe test 2 were displayed.The location of the escape platform (removed for the probe test) was represented by a solid circle.All post-hoc comparisons were based on Fisher’s LSD.Values were expressed as *P<0.05,**P<0.01 vs App/Ps1 genotype mice.

3 討論

本研究通過系列行為學實驗探討了Ps1突變基因對阿爾茨海默病模型鼠表觀有效性的影響。曠場實驗中發現與App/Ps1雙轉基因小鼠相比，App單轉基因小鼠總的活動距離、中心區域活動距離、進入中心區域頻率百分比均增加(Fig 4A-4C)，說明App單轉基因小鼠無法更好的模擬AD的自發活動、探索及抑郁樣行為。此外，與App/Ps1雙轉基因小鼠相比，App單轉基因小鼠活動速度增快(Fig 4D)，說明App單轉基因小鼠無法更好模擬AD活動機能減弱表現。高架十字迷宮實驗結果顯示，與App/Ps1雙轉基因小鼠相比，App單轉基因小鼠在開放臂的頻率百分比及時間百分比均顯著增加(Fig 5A，5B)，說明App單轉基因小鼠不能更好模擬AD焦慮樣行為。新物體與新位置識別實驗發現，與App/Ps1雙轉基因小鼠相比，App單轉基因小鼠識別指數百分比明顯增加(Fig 6A，6B)，說明App單轉基因小鼠不能更好模擬AD認知與記憶受損的行為表現，該實驗與Morris水迷宮實驗結果相一致。在水迷宮實驗中，與App/Ps1雙轉基因小鼠相比，App單轉基因小鼠在獲得性訓練測試與對位訓練測試中尋找到平臺的距離與時間均減少(Fig 7B，7C)，說明App單轉基因小鼠不能更好模擬AD認知與記憶受損的行為表現。另外，與App/Ps1雙轉基因小鼠相比，App單轉基因小鼠在獲得性訓練測試與對位訓練測試中游泳速度增快(Fig 7D)，說明App單轉基因小鼠不能更好模擬AD活動機能減弱的行為學表現，這與曠場實驗中小鼠運動速度結果一致。Ps1蛋白在海馬和新皮質的錐體細胞、腦干活動神經元及骨骼肌中均有表達[11]，Holtzer 等[12]研究報道，步行速度減慢與認知功能障礙是經常同步出現的，這與本實驗結果相一致。探查測試1結果顯示：與App/Ps1雙轉基因小鼠相比，App單轉基因小鼠在目標象限內運動的距離與時間百分比均明顯增加(Fig 7E，7F)，說明Ps1基因轉入加速阿爾茨海默病模型小鼠認知損傷。另外，在水迷宮實驗探查測試2中，與App/Ps1雙轉基因小鼠相比，App單轉基因小鼠在目標象限內運動的距離及時間百分比均顯著增加(Fig 7G，7H)，提示Ps1基因轉入加速阿爾茨海默病模型小鼠學習記憶的衰退。

國內外文獻[13-14]表明，Ps1基因突變不僅可以改變App的剪切位點，誘導Aβ42增加，還可以通過干擾細胞內鈣穩態，增加ROS的生成，提高神經元對營養因子消耗的敏感性，誘導神經元凋亡。Inestrosa等[15]報道了Ps1基因突變的細胞內Akt/PKB活性減弱，由于Akt/PKB對GSK-3β有抑制作用，從而增強了GSK-3β對β-catenin磷酸化的作用。本實驗所研究的阿爾茨海默病APPswe/PS1dE9雙轉基因模型小鼠是Jankow-sky在2004年首次建立的，將人鼠嵌合型基因Mo/Hu APP695和含有第9個外顯子突變的人Ps1基因(Hu-PS1dE9)在胚胎期直接注入受精卵并整合到染色體的同一個基因座。Jankow-sky等[16]研究發現，在APPswe轉基因小鼠中共表達Ps1-dE9可特異性增加Aβ42的水平而不會改變Aβ40，然而目前關于Ps1-dE9轉入會導致認知障礙加速的研究尚未見任何報道。因此，本實驗研究了Ps1基因在阿爾茨海默病中的重要功能，通過對比App單轉基因小鼠及App/Ps1雙轉基因小鼠在認知、學習、記憶功能及自主活動、情緒方面的異同，發現Ps1基因的轉入能夠更好的模擬阿爾茨海默病模型鼠運動機能減弱，情緒異常及認知、學習、記憶功能障礙。

綜上所述，Ps1突變基因顯著增加了阿爾茨海默病模型(App/Ps1雙轉基因)小鼠的焦慮、抑郁樣行為，并伴隨自發活動減少、速度減慢及認知學習及記憶受損的行為學表現。這些結果證明了Ps1-dE9轉入會導致認知障礙進一步加速，對AD的機制研究及靶向藥物研發具有重要價值。