木犀草素通過抑制Akt/IKK信號通路抑制膀胱癌5637細胞遷移、侵襲和上皮間質轉化

胡藝還，高 靜，楊寧剛，李彩麗，徐曉莉，李 樂，黃雙盛

(西北民族大學 1.醫學院、2.醫院，甘肅 蘭州 730030；3.蘭州市第一人民醫院泌尿科，甘肅 蘭州 730050；4.蘭州大學基礎醫學院，甘肅 蘭州 730000)

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤。其全球發病率在36種惡性腫瘤中位居第十位[1]，在我國，膀胱癌發病位居全部惡性腫瘤的第13位，而死亡率位居全部惡性腫瘤死亡的第12位。其發病率和死亡率均占泌尿系統腫瘤首位，并呈逐年上升的趨勢[2]。復發、轉移是臨床治療失敗的主要原因。

上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)是指具有極性的上皮細胞發生表型轉換獲得間質細胞表型的過程。通過EMT，腫瘤細胞開始從原發灶脫離并獲得侵襲遷移能力。因此，EMT是啟動腫瘤侵襲轉移的關鍵所在，抑制EMT發生可作為抑制腫瘤侵襲轉移的一種重要手段[3]。研究表明，EMT的發生是腫瘤微環境和腫瘤細胞相互作用的結果，多種生長因子、信號途徑參與這一過程，其中轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是迄今研究最為深入的調節EMT過程的重要細胞因子，在多種腫瘤組織發現TGF-β過表達[4]。而在膀胱癌，研究發現從癌組織分離的腫瘤相關成纖維細胞主要通過分泌TGF-β1誘導膀胱癌細胞發生EMT[5]。

木犀草素(luteolin)是一種天然黃酮類化合物，化學結構為3′，4′，5，7-四羥基黃酮，廣泛存在于多種中草藥及蔬菜水果中，具有抗氧化、抗炎、抗過敏以及抗腫瘤等活性[6]。其抗腫瘤作用與抑制腫瘤細胞增殖、誘導凋亡，抗血管生成以及增敏抗癌藥物活性等有關[7]。木犀草素還能抑制多種腫瘤細胞如胃癌[8]、肺癌[9]、乳腺癌[10]等侵襲遷移。研究證實[11]，木犀草素能有效抑制膀胱癌細胞BIU-87細胞的增殖，阻滯細胞周期，誘導BIU-87細胞凋亡。但它如何影響膀胱癌的侵襲、轉移目前尚未見報道。因此，本研究將觀察木犀草素對膀胱癌5637細胞遷移、侵襲、基質金屬蛋白酶-2/9 (matrix metalloproteinase-2/9，MMP-2/9)分泌影響，并通過建立TGF-β誘導的EMT模型，觀察木犀草素對TGF-β誘導的EMT及相關信號通路蛋白表達的影響，以探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人膀胱癌5637細胞購自中科院上海細胞庫，由本實驗室傳代保存。

1.1.2藥物和試劑 木犀草素由蘭州大學基礎醫學院張小郁教授惠贈，純度為98%；RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司(貨號：31800-022)；胎牛血清購自烏拉圭 Lonsera公司(貨號：S711-001S)；磺酰羅丹明B (sulforhodamine B，SRB) (貨號：S1402-5G)和明膠(貨號：G2500-100G)購自Sigma公司；插入式細胞培養皿(Millicell cell culture inserts)購自Millipore公司(貨號：P18P01250)；基質膠(Matrigel)(貨號：356234)、轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)(貨號：7754-BH-005)購自BD公司；RIPA細胞裂解液(含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)購自碧云天生物公司(貨號：P0013B)；E-cadherin(貨號：ab40772)、N-cadherin(貨號：ab18203)、Vimentin(貨號：ab92547)、IKK(貨號：ab178870)、p-IKK(貨號：ab194528)、β-Actin(貨號：ab8227)一抗和相關二抗購自Abcam公司；Akt(貨號：4691)、p-Akt(貨號：9271)、Slug(貨號：9585)抗體購自Cell Signaling Technology公司；化學發光試劑購自美國Thermo Fisher公司(貨號：34077)；其它試劑均為國產分析純。

1.1.3儀器 細胞培養箱(SHELLAB公司)；酶標儀(上?？迫A生物工程有限公司)；倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)；化學發光凝膠成像儀(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 5637細胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中傳代培養。取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2SRB法 取指數生長期5637細胞消化，制成細胞懸液，調整細胞濃度為3 × 107～5×107個·L-1，然后每孔100 μL接種在96孔板。培養24 h后，加入不同濃度木犀草素，繼續培養24、48、72 h后，將細胞取出，加入預冷的50%三氯乙酸(最終濃度10%)在4 ℃固定1 h。然后用去離子水沖洗5次，晾干，加入0.4%的SRB染料染色10 min，再用0.1%醋酸洗5次，過夜晾干。結合在細胞的SRB用150 μL 1% Tris堿溶解，用酶標儀在570 nm波長處測定吸光度值，計算細胞存活率。

1.2.3Transwell法檢測細胞遷移 細胞遷移在插入式細胞培養皿Millicell中進行，其中聚碳酸酯膜的膜孔直徑是8 μm。取5637細胞，用不含血清的RPMI 1640培養基制成細胞懸液，細胞濃度為1×109·L-1。取0.4 mL細胞懸液加到Millicell上室，同時加入不同濃度木犀草素，下室加入含20%血清的RPMI 1640培養基0.6 mL，37 ℃培養24 h，取出培養小室，將聚碳酸酯膜里面未遷移的細胞用棉簽刮掉，膜外面遷移過去的細胞用甲醇固定，0.1%結晶紫染色，顯微鏡下隨機選擇視野拍照。用ImageJ軟件對穿過微孔膜的細胞計數。

1.2.4Transwell法檢測細胞侵襲 細胞侵襲同樣在插入式細胞培養皿Millicell中進行。取出已經融化的Matrigel，用預冷的RPMI 1640按Matrigel ∶1640=1 ∶8的比例稀釋，然后取稀釋液50 μL加到Millicell上室，以上操作均在冰上進行。然后置37 ℃培養箱1 h 待Matrigel凝固后，取5637細胞，用不含血清的RPMI 1640培養基制成細胞懸液，細胞濃度為1.5×109·L-1，其余操作與“1.2.3”相同。

1.2.5明膠酶譜實驗 取出即將長滿單層的5637細胞，加入含有不同濃度木犀草素RPMI-1640培養基(含1%血清)，置37 ℃培養箱繼續培養24 h，收集上清液。取上清液，加入不含β-巰基乙醇的上樣緩沖液，37 ℃水浴共同孵育0.5 h，上樣，進行7.5%的SDS-PAGE電泳(其中分離膠加入1%明膠)，電泳結束后，將凝膠置于洗脫液振蕩洗脫1 h。再將膠放入孵育緩沖液，37 ℃孵育使酶復性。36 h后取出凝膠，用 0.25% 考馬斯亮藍R250染色。然后放入脫色液脫色，直至藍色的膠上出現白色條帶。

1.2.6Western blot檢測 取即將長滿單層的5637細胞，加入不同濃度木犀草素，24 h后，收集細胞，PBS洗滌，加入RIPA裂解液，置冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，取上清，用Bradford 法測定蛋白含量。每組取40 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，濕式轉移法轉移至PVDF膜，TBST洗膜3次，5%脂奶粉封閉1 h，TBST洗滌3次，加入一抗4 ℃孵育過夜，洗滌，再加入二抗室溫孵育2 h，洗滌，加入發光試劑，用凝膠成像儀進行檢測。利用ImageJ軟件對蛋白條帶進行灰度分析。

2 結果

2.1 木犀草素抑制5637細胞增殖如Fig 1所示，木犀草素對5637細胞增殖有明顯抑制作用，且呈濃度和時間依賴性。木犀草素處理24、48、72 h的半數抑制濃度(IC50)分別為53.63、23.12、15.33 mg·L-1。由于6.25 mg·L-1的木犀草素作用24 h對5637細胞增殖無明顯抑制作用，因此我們選用最大濃度6.25 mg·L-1作用24 h進行后續實驗。

Fig 1 Proliferation of 5637 cells after treatment for 24,48,72 h inhibited by luteolin n=4)*P<0.05,**P<0.01 vs control group

2.2 木犀草素抑制5637細胞遷移如Fig 2所示，加入20%血清能明顯誘導5637細胞向Transwell下室遷移，不同濃度木犀草素(1.56、3.13、6.25 mg·L-1)處理24 h明顯抑制血清誘導的5637細胞遷移，抑制率分別為27.44%、48.91%、71.68%。

2.3 木犀草素抑制5637細胞侵襲如Fig 2所示，血清作為趨化因子能誘導5637細胞侵襲并穿過Matrigel，而用1.56、3.13、6.25 mg·L-1的木犀草素處理5637細胞24 h能明顯抑制5637細胞侵襲，抑制率分別為36.57%、53.32%、73.55%。

Fig 2 Migration and invasion of 5637 cells inhibited by luteolin (×200) n=4)*P<0.05,**P<0.01 vs control group

2.4 木犀草素抑制5637細胞MMP-2、MMP-9分泌如Fig 3所示，6.25 mg·L-1木犀草素能抑制對5637細胞MMP-2分泌；而12.5、25 mg·L-1木犀草素對5637細胞MMP-2、MMP-9分泌均有明顯抑制作用。與對照組相比較，差異有統計學意義。

Fig 3 MMP-2/9 secretion by 5637 cells inhibited by luteolin n=5)*P<0.05,**P<0.01 vs control group

2.5 木犀草素對5637細胞EMT相關蛋白表達的影響如 Fig 4所示，與對照組比較，5637細胞經入5 μg·L-1TGF-β處理24 h后，上皮細胞標志物E-cadherin表達明顯降低，而間質細胞標志物N-cadherin、Vimentin表達明顯升高，EMT相關轉錄因子Slug表達也明顯升高。這說明加入5 μg·L-1TGF-β處理24 h誘導5637細胞發生了EMT。與TGF-β處理組比較，加入不同濃度木犀草素對TGF-β誘導E-cadherin降低無明顯影響，但能明顯抑制TGF-β誘導的N-cadherin、Vimentin以及Slug表達升高。這表明木犀草素對TGF-β誘導5637細胞EMT發生有抑制作用。

Fig 4 TGF-β-induced EMT of 5637 cells inhibited by #P<0.05,##P<0.01 vs control group;*P<0.05,**P<0.01 vs TGF-β treatment alone

2.6 木犀草素對TGF-β誘導EMT相關信號分子表達的影響如Fig 5所示，與對照組比較，TGF-β處理不影響總的Akt、IKK表達，但p-Akt、p-IKK的表達升高，說明TGF-β處理能誘導Akt、IKK發生磷酸化。與TGF-β處理組比較，加入木犀草素處理后總的Akt、IKK以及p-Akt、p-IKK表達均出現下降。提示木犀草素抑制TGF-β誘導5637細胞EMT發生與抑制TGF-β/Akt/IKK信號通路有關。

Fig 5 Expression of Akt,p-Akt,IKK and p-IKK inhibited by luteolin n=3)#P<0.05,##P<0.01 vs control group;*P<0.05,**P<0.01 vs TGF-β treatment alone

3 討論

膀胱癌是泌尿系常見的惡性腫瘤，具有高復發、高進展、高異質性等特點。作為腫瘤侵襲轉移的起始事件，EMT與膀胱癌尤其是肌層侵潤性膀胱癌轉移、對化療的耐藥性以及預后都密切相關[12]。近年來，天然產物由于具有來源廣、類型多、不良反應小等優點，因此從中尋找靶向EMT抑制劑越來越受到人們的關注[13]。相關研究表明，木犀草素能夠逆轉多種腫瘤細胞EMT發生從而抑制腫瘤侵襲遷移[8-10]，而木犀草素如何影響膀胱癌侵襲和轉移目前尚未見報道。研究結果表明，木犀草素能抑制膀胱癌5637細胞遷移、侵襲及MMP-2/9分泌并且能夠逆轉TGF-β誘導的EMT過程。

TGF-β對腫瘤的影響有雙重性，在腫瘤形成的早期階段，TGF-β通過抑制腫瘤細胞的生長、誘導腫瘤細胞凋亡而產生抑制效應；但在腫瘤的進展階段，TGF-β卻通過誘導腫瘤細胞發生EMT而促進腫瘤的發展。研究表明[14]TGF-β誘導EMT發生涉及兩條主要的信號通路，即TGF-β/SMAD和TGF-β/非SMAD信號通路，其中非SMAD依賴的TGF-β信號通路有多條，包括PI3K/Akt以及Ras/MAPK信號通路等。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，活化的Akt通過磷酸化激活多種底物(包括GSK-3β、IKK等)從而參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移以及侵襲過程[15]。通常情況下，NF-κB在細胞質與IκB結合沒有轉錄活性，而當IKK被Akt等上游信號磷酸化激活后，活化的IKK則磷酸化IκB進而使IκB通過泛素化途徑被降解，于是NF-κB得以釋放并發生核轉位進而激活下游靶基因轉錄[16]。在本研究中，我們發現TGF-β處理5637細胞不影響總的Akt、IKK表達，但能誘導Akt、IKK磷酸化。而加入木犀草素后Akt、IKK以及p-Akt、p-IKK表達均有所降低，這表明木犀草素抑制TGF-β誘導5637細胞EMT發生與抑制TGF-β/Akt/IKK信號通路有關。Chen等[9]報道木犀草素可通過影響PI3K/Akt-NF-κB-Snail通路而抑制TGF-β1誘導的肺癌細胞發生EMT。我們的結果與Chen等報道一致。

然而，如上所述，EMT的發生是腫瘤微環境和腫瘤細胞相互作用的結果，多種生長因子、多條信號途徑參與這一過程。從已有報道看，木犀草素可通過影響多條信號途徑逆轉多種因素誘導的EMT。例如Ruan等[17]報道木犀草素能夠通過抑制integrinβ1/FAK信號通路抑制低氧誘導的小細胞肺癌細胞發生EMT；Liu等[18]研究表明木犀草素抑制結腸癌細胞EMT則是通過抑制cAMP反應元件結合蛋白1(CREB1)表達；而Zang等[8]發現木犀草素通過抑制Notch信號通路而抑制胃癌細胞EMT發生。而目前我們只通過建立TGF-β誘導的EMT模型，研究了木犀草素對Akt/IKK信號通路的影響。因此通過建立多種EMT模型，進一步探討木犀草素逆轉EMT的分子機制并通過體內實驗研究木犀草素對膀胱癌侵襲轉移的影響將是我們下一步研究的方向。

綜上所述，本研究結果表明木犀草素能抑制膀胱癌5637細胞遷移、侵襲、MMP-2/9分泌及TGF-β誘導的EMT發生，其機制與抑制Akt/IKK信號通路有關。這一結果為木犀草素今后的開發利用提供了重要的實驗依據。