石斛酚對同型半胱氨酸誘導的人微血管內皮細胞NLRP3炎性體激活的影響

王 偉，陳亞軍，耿 明，徐忠東，戴 敏

(1.合肥師范學院生命科學學院，安徽 合肥 230601；2.安徽中醫藥大學藥學院，安徽省中藥研究與開發重點實驗室，新安醫學教育部重點實驗室，安徽合肥 230031)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種動脈內膜炎性疾病，其并發癥如心肌梗塞和中風是全世界范圍內最常見的死亡原因[1]。前期研究證實血漿同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)升高是AS獨立危險因素[2]。Hcy可促進血管壁炎性單核細胞分化和巨噬細胞成熟，誘導血管炎癥反應，加速AS病理進程[3]，然而Hcy誘導的血管炎癥反應具體機制仍不清楚。近期發現[4]，血管內皮細胞中Nod樣受體蛋白3(NOD-leucine rich repeat and pyrin containing protein 3，NLRP3)炎性體激活在AS的病理過程中起重要作用。NLRP3炎性體能夠被包括Hcy在內的多種內外源性物質激活。體外實驗發現，Hcy可通過升高細胞內ROS，激活NLRP3炎性體，誘導人血管內皮細胞程序性細胞死亡[5]。NLRP3炎性體激活可促進白細胞介素-1β(interleukin-1 beta，IL-1β)的分泌。IL-1β可介導血管內皮細胞炎癥反應，促進血管平滑肌細胞增殖等病理過程參與AS發生和發展[6]。因此，抑制血管內皮細胞NLRP3炎性體激活對防治AS具有重要意義。

石斛酚(gigantol)，一種聯芐類酚性物質，是石斛的藥用有效成分之一。既往研究表明[7]，石斛酚能通過核因子-κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)信號途徑抑制細菌內毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的小鼠巨噬細胞IL-1β的分泌。石斛酚可減少高葡萄糖誘導的小鼠腎小球系膜細胞活性氧物質(reactive oxygen species，ROS)水平，起到腎臟保護作用[8]。我們前期利用載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E knockout，ApoE-/-)小鼠AS模型發現，石斛酚可明顯抑制模型鼠主動脈黏附分子和趨化因子表達，減少主動脈斑塊面積[9]。上述發現提示，石斛酚具有潛在的抑制血管內皮細胞炎癥反應作用，然而其具體抗炎機制目前仍不清楚。因此，本實驗采用Hcy誘導的人微血管內皮細胞炎癥模型，從NLRP3炎性體通路分析石斛酚抗血管內皮細胞炎癥反應作用及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑人微血管內皮細胞(human microvascular endothelial cells，HMEC-1)購自ATCC；Hcy(#H4628)購自美國Sigma公司；石斛酚(純度≥95%，#CHB-S-051)購自成都克洛瑪生物科技有限公司，實驗時采用二甲基亞砜助溶，終濃度不超過0.1%；胎牛血清(FBS，#04-001-1ACS)和DMEM培養基(高糖型，#06-1055-57-1ACS)購自以色列BI公司；細胞活性檢測試劑盒(#C0009)、細胞蛋白裂解液(#P0013)、蛋白定量試劑盒(#P0010)、ROS檢測試劑盒(#S0033M)購自上海碧云天公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate-specific protease-1,Caspase-1)抗體(#3866)購自美國CST公司；NLRP3抗體(#ab214185)、凋亡相關點狀樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC)抗體(#ab155970)和硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)抗體(#ab188865)購自英國Abcam公司；GAPDH抗體(#10494-1-AP)購自美國Proteintech公司；ELISA檢測試劑盒(#DLB50)購自美國R&D公司；其余試劑均為化學分析純。

1.2 細胞培養37 ℃水浴復蘇液氮保存的HMEC-1細胞，加入正常細胞培養液(含10%FBS的DMEM培養基)，混勻后離心(500×g，5 min)，細胞以1×108·L-1密度接種于細胞培養皿(100 mm)，在37 ℃、5%CO2培養箱內培養，后續實驗采用對數生長期細胞。

1.3 細胞活性檢測HMEC-1細胞以1×107· L-1密度接種96孔板，分別用Hcy(100 μmol·L-1)或石斛酚(1、5、10 μmol·L-1)處理HMEC-1細胞48 h，對照組加正常培養液，檢測步驟嚴格按照細胞活性檢測試劑盒(MTT法)說明書進行，酶標儀測定(美國MD公司，M2)各孔OD(570 nm)值。上述96孔板中，各處理條件另保留不加MTT孔，用于倒置顯微鏡(日本Olympus公司，#IX71)觀察細胞形態學變化。

1.4 ELISA法測定HMEC-1細胞上清液中IL-1β含量HMEC-1細胞以2×109·L-1濃度接種6孔板，分別用Hcy(100 μmol·L-1)、Hcy(100 μmol·L-1)+石斛酚(1、5、10 μmol·L-1)處理HMEC-1細胞48 h，對照組加正常培養液，IL-1β含量嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測。

1.5 Western blot 檢測HMEC-1細胞NLRP3、ASC、Caspase-1和TXNIP蛋白水平HMEC-1細胞以2×109·L-1濃度接種6孔板，分組同“1.4”，分別收集各組處理細胞12 h(檢測TXNIP蛋白)和24 h(檢測NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白)蛋白樣品。每孔加入細胞蛋白裂解液150 μL，裂解后4 ℃離心(13 000×g,5 min)，上清液中總蛋白濃度經試劑盒定量(BCA法)。總蛋白經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉膜(PVDF)，非特異性抗原封閉1 h后，分別孵育不同一抗：NLRP3抗體(1 ∶500)、ASC抗體(1 ∶2 000)、Caspase-1抗體(1 ∶1 000)、TXNIP抗體(1 ∶2 000)和GAPDH抗體(1 ∶10 000)，4 ℃過夜，去除一抗后，HRP標記的二抗(1 ∶5 000)反應2 h。ECL化學發光試劑顯色，用ImageJ(1.8.0)軟件分析化學發光儀(上海天能科技有限公司，#5200)拍攝的條帶灰度值。

1.6 流式細胞儀檢測HMEC-1細胞ROS水平[10]細胞以2×109·L-1密度接種6孔板，分組同1.4，各組處理30 min后胰蛋白酶消化收集細胞，ROS熒光探針DCFH-DA(10 μmol·L-1)37 ℃避光孵育20 min后，用PBS漂洗細胞3次，流式細胞儀(美國BD公司，#C6)在FL-1通道檢測細胞ROS水平。

2 結果

2.1 Hcy、石斛酚對HMEC-1細胞形態學和活性的影響與對照組相比，Hcy(100 μmol·L-1)、石斛酚(1～10 μmol·L-1)作用HMEC-1細胞48 h，細胞形態學未觀察到明顯變化(Fig 1A)。細胞活性實驗發現，與對照組相比，Hcy(100 μmol·L-1)、石斛酚各劑量組OD值差異均無統計學意義(Fig 1B)，表明本實驗體系中Hcy和石斛酚所采用濃度對HMEC-1細胞形態學和活性無明顯影響。

Fig 1 Effect of Hcy or gigantol on cell viability of cultured HMEC-1 cells n=6)A：Cell morphology (×400);B：MTT assay.1:Control;2:Hcy(100 μmol·L-1);3:Gigantol(1 μmol·L-1);4:Gigantol(5 μmol·L-1);5:Gigantol(10 μmol·L-1)

2.2 石斛酚對Hcy誘導的HMEC-1細胞IL-1β分泌的影響與對照組相比，Hcy(100 μmol·L-1)作用HMEC-1細胞48 h后，細胞培養液中IL-1β水平明顯增加(Fig 2)。與Hcy組相比，石斛酚(5～10 μmol·L-1)可明顯減少培養液中IL-1β濃度(Fig 2)，表明石斛酚對Hcy誘導的HMEC-1細胞IL-1β分泌具有明顯的抑制作用。

Fig 2 Gigantol inhibits Hcy induced IL-1β secretion in 1:Hcy(100 μmol·L-1);2:Gigantol(1 μmol·L-1);3:Gigantol(5 μmol·L-1);4:Gigantol(10 μmol·L-1).##P<0.01 vs control group,**P<0.01 vs Hcy group

2.3 石斛酚對Hcy誘導的HMEC-1細胞NLRP3炎性體的影響Hcy(100 μmol·L-1)作用HMEC-1細胞24 h后，NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達明顯升高(Fig 3)。與Hcy組相比，石斛酚(5～10 μmol·L-1)可明顯抑制Hcy誘導的NLRP3炎性體激活(Fig 3)，表明石斛酚干預Hcy誘導的HMEC-1細胞炎癥反應可能通過抑制NLRP3炎性體激活。

Fig 3 Gigantol inhibits Hcy induced NLRP3 inflammasome activation in HMEC-1 cells n=3)#P<0.05,##P<0.01 vs control group,*P<0.05,**P<0.01 vs Hcy group

2.4 石斛酚對Hcy誘導的HMEC-1細胞TXNIP蛋白表達的影響Hcy(100 μmol·L-1)作用HMEC-1細胞12 h后，TXNIP蛋白表達明顯升高(Fig 4)。與Hcy組相比，石斛酚各劑量組可明顯減少TXNIP蛋白表達(Fig 4)，表明石斛酚可能通過調節TXNIP蛋白表達，抑制Hcy誘導的HMEC-1細胞NLRP3炎性體激活。

Fig 4 Hcy induced TXNIP expression in HMEC-1 cells inhibited by gigantol n=3)1:Hcy(100 μmol·L-1);2:Gigantol(1 μmol·L-1);3:Gigantol(5 μmol·L-1);4:Gigantol(10 μmol·L-1).##P<0.01 vs control group,*P<0.05,**P<0.01 vs Hcy group

2.5 石斛酚對Hcy誘導的HMEC-1細胞ROS水平的影響Hcy(100 μmol·L-1)作用HMEC-1細胞30 min后，細胞ROS水平明顯增加(Fig 5)。與Hcy組相比，石斛酚(5～10 μmol·L-1)可明顯減少細胞ROS含量(Fig 5)，提示石斛酚可能通過ROS/TXNIP通路抑制Hcy誘導的內皮細胞NLRP3炎性體激活。

Fig 5 Hcy induced ROS generation in HMEC-1 cells inhibited by gigantol ##P<0.01 vs control group,**P<0.01 vs Hcy group

3 討論

血管內皮細胞炎癥反應是AS發生的始動環節[11]。Hcy可誘導血管內皮細胞炎癥反應[12]，參與AS病理進程。本實驗發現，Hcy可升高HMEC-1細胞ROS水平，上調NLRP3、ASC、Caspase-1及TXNIP蛋白水平，促進IL-1β分泌。石斛酚能明顯逆轉Hcy誘導的氧化應激，抑制NLRP3炎性體激活，減輕內皮細胞炎癥反應。因此，上述發現提示，石斛酚對高同型半胱氨酸血癥相關的血管炎癥和AS可能具有潛在治療作用。

血管內皮細胞被認為是一種非典型免疫細胞，其能表達Toll樣受體和CD36清道夫受體等模式識別受體，參與NF-κB信號的激活。近期研究發現，Hcy可通過升高細胞內ROS，激活NLRP3炎性體，誘導人血管內皮細胞焦亡和調亡[5]。與前期報道一致[5]，本研究發現Hcy能上調HMEC-1細胞NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白水平，增強IL-1β分泌，提示HMEC-1細胞NLRP3炎性體激活模型成功建立。然而，本研究未觀察到Hcy刺激的HMEC-1細胞出現明顯的活性和形態學變化，這可能與我們使用的Hcy濃度較低有關。此外，我們也發現Hcy能明顯提升HMEC-1細胞內ROS水平。ROS已被證明可作為上游信號分子參與激活NLRP3炎性體。硫氧還蛋白/TXNIP是一種對氧化還原敏感的信號復合物，已成為氧化還原調節與血管衰老相關疾病發病機制之間聯系的關鍵組分[13]。ROS可誘導TXNIP與NLRP3結合，從而引起NLRP3炎性體激活和肺內皮細胞分泌IL-1β[14]。我們之前在高葡萄糖誘導的肝細胞和果糖誘導的足細胞等體外細胞損傷模型中發現，ROS/TXNIP通路參與了NLRP3炎性體激活[15-16]。本實驗發現Hcy作用HMEC-1細胞12 h后能明顯提升細胞中TXNIP蛋白表達水平。因此，我們推測ROS/TXNIP通路可能參與了Hcy激活的HMEC-1細胞NLRP3炎性體。

石斛酚抗炎特性逐漸受到關注。體外實驗發現，石斛酚可通過NF-κB途徑抑制LPS誘導的小鼠巨噬細胞炎性因子IL-1β的釋放[7]，通過ROS/MAPK/NF-κB通路減少高葡萄糖誘導的小鼠腎小球系膜細胞調亡[8]。在高葡萄糖誘導的人視網膜微血管內皮細胞損傷模型中發現，石斛酚可抑制醛糖還原酶(aldose reductase，AR)/NF-κB信號激活，減少細胞內ROS水平[17]。我們前期研究發現，石斛酚可抑制主動脈粘附分子(ICAM-1和VCAM-1)和趨化因子(MCP-1)mRNA水平，明顯減小ApoE-/-小鼠主動脈粥樣斑塊[9]。本實驗發現，石斛酚能逆轉Hcy誘導的NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白過表達，抑制IL-1β分泌，提示石斛酚對Hcy誘導的HMEC-1細胞NLRP3炎性體激活具有明顯的抑制作用。此外，Hcy誘導的細胞ROS升高和TXNIP蛋白過表達均可被石斛酚明顯逆轉，提示ROS/TXNIP信號通路可能參與石斛酚對Hcy誘導的NLRP3炎性體激活的抑制作用。石斛酚對NLRP3炎性體具體調控機制還有待于后續采用ROS清除劑或TXNIP抑制劑等進一步驗證。

綜上所述，我們發現石斛酚能抑制Hcy誘導的HMEC-1細胞NLRP3炎性體激活，緩解血管內皮細胞炎癥反應，ROS/TXNIP通路可能參與其中。本實驗初步揭示了石斛酚抑制血管內皮細胞炎癥反應的分子作用機制，為石斛酚防治高同型半胱氨酸血癥相關的血管性疾病研究提供了新的實驗依據。