長鏈非編碼RNA-H19通過促進肺腺癌細胞的上皮-間充質轉化促進其增殖和侵襲能力

楊志一，鄭 荃，車興念，張麗萍，周丹丹，尹崇高，李洪利，劉雨清

(濰坊醫學院1.病理學教研室、2.護理學院、3.醫學研究實驗中心，山東 濰坊 261053)

在過去的30年間，癌癥的總死亡率持續下降27%，使實際癌癥死亡人數比死亡率保持在高峰時期的預期死亡人數減少約200萬人[1]。大多數癌癥的存活率呈穩步上升趨勢，與之相比，肺癌的進展一直比較緩慢，部分原因是超過半數病例在晚期階段才得以診斷，肺癌相關死亡以≥40歲男性和60歲女性為主；另一方面則由于侵襲轉移，肺癌患者死亡率居高不下[2]。肺腺癌是肺癌中占比最多的組織學類型，是發病率最高的肺癌類型之一，其死亡率也較高。

上皮-間充質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的主要特征是胞間粘附的喪失，以致遷移侵襲能力增加。從靜止上皮細胞到活動間充質細胞的反式分化對于胚胎發生、纖維化、組織修復、傷口愈合和腫瘤進展至關重要[3]。在癌癥中，EMT多發生在轉移的初始階段，而肺癌的診斷大多在晚期階段，化療耐藥性使其治療難度增加[4]。因而更有潛力的標志物和替代治療手段愈加需要。在人類基因組中，長鏈非編碼RNA-H19(long non-coding RNA-H19，LncRNA-H19)定位于11p15.5[5]。在癌癥中，LncRNA-H19通常高表達，并與癌癥發展的許多方面有關[6]。LncRNA-H19可促進肺癌細胞的耐藥性或調控miRNA從而促進肺癌細胞的凋亡等[7-8]，但其是否參與肺腺癌的淋巴結轉移或遠處轉移以及侵襲轉移的機制仍未完全清楚。因此本研究通過檢測LncRNA-H19在伴或不伴淋巴結轉移的肺腺癌組織中的表達情況，探討LncRNA-H19對肺腺癌細胞增殖侵襲能力的影響，為預防肺腺癌的侵襲轉移提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 QuantiNova SYBR Green PCR Kit購自德國Qiagen公司，Transwell 小室購自 Corning 公司，Matrigel 購自BD公司，抗體鼠抗人 β-actin單抗(ab8226)(1∶1 000)、鼠抗人 E-cadherin 單抗 (ab1416)(1 ∶500)、鼠抗人 Vimentin單抗(ab8978)(1 ∶1 000)購自Abcam公司。

1.1.2組織樣本 收集伴或不伴淋巴結轉移的肺腺癌組織各32例。患者為2014年1月～2018年1月于濰坊醫學院附屬醫院就診，肺腺癌病理診斷明確。所有納入研究的患者均簽署知情同意書，術前未接受放化療。

1.1.3儀器 高速低溫離心機、CO2培養箱、ABI 7500 FAST Real-Time PCR儀 (Thermo Fisher Scientific公司) ，雙垂直電泳槽、梯度PCR儀(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 人肺腺癌細胞NCI-H1299 和A549分別使用RPMI 1640 培養基和Ham's F-12K培養基并含體積分數為0.1的胎牛血清，人正常肺支氣管上皮細胞BEAS-2B使用DMEM 培養基含體積分數為0.1的胎牛血清，均于5% CO2，37 ℃培養箱中培養。將細胞分組，1) NCI-H1299組：常規培養，不做任何處理；2) NCI-H1299/Si-NC組：轉入敲減對照質粒；3) NCI-H1299/Si-LncRNA-H19 組：轉入LncRNA-H19敲減質粒；4) A549 組：常規培養，不做任何處理；5) A549/NC組：轉入過表達對照質粒；6) A549/LncRNA-H19 組：轉入LncRNA-H19過表達質粒。

1.2.2實時熒光定量PCR 轉染24 h后，TRIzol法提取各組細胞的總RNA，逆轉錄后使用QuantiNova SYBR Green PCR Kit進行聚合酶鏈式反應。引物序列如下：LncRNA-H19 上游引物：5′-CAGTGG ACTTGGTGACGCTGTATG-3′，下游引物：5′-CGCC TCGCCTAGTCTGGTCTC-3′；GAPDH上游引物：5′-G TTGGAGGTCGGAGTCAACGG-3′，下游引物：5′-GAG GGATCTCGCTCCTGGAGGA-3′。GAPDH作為內參，3次獨立重復實驗。

1.2.3CCK-8增殖實驗 收集各組細胞，每組設置4個復孔，每孔2×103個細胞鋪于96孔板中。常規培養，分別在d 1、d 2、d 3和d 4加入10 μL CCK-8溶液，孵育1 h后測定450 nm處的吸光度。3次獨立重復實驗。

1.2.4Transwell侵襲實驗 實驗步驟參照課題組文獻[9]。37 ℃ 5% CO2孵育24 h后，PBS洗滌上室，使用100%甲醇固定，配制Giemsa染色液對細胞進行染色，顯微鏡下拍照。隨機選取6個視野拍照并進行統計學分析。3次獨立重復實驗。

1.2.5Western blot實驗 提取各組轉染細胞的總蛋白，用于SDS-PAGE凝膠電泳。按照相應抗體的稀釋度在5%阻斷緩沖液中制備一抗。4 ℃孵育過夜后室溫洗滌，二抗孵育1 h。洗滌后，使用ECL化學發光液顯影。β-actin作為內參，3次獨立重復實驗。

1.2.6統計學分析 收集實驗所得數據，使用SPSS 24.0進行統計學分析。兩獨立樣本t檢驗應用于計量資料的兩組間比較，單因素方差分析用于多組間比較。

2 結果

2.1 伴有淋巴結轉移的肺腺癌組織與不伴淋巴結轉移的肺腺癌組織相比LncRNA-H19表達上調分別收集伴或不伴淋巴結轉移的肺腺癌組織各32例，分別檢測樣本中LncRNA-H19的表達量，如Fig 1所示，LncRNA-H19在伴有淋巴結轉移的肺腺癌組織中的表達量明顯高于不伴淋巴結轉移的肺腺癌組織(P<0.05)。

Fig 1 The relative expression of LncRNA-H19 in non-metastatic and metastatic lung adenocarcinoma tissues detected by *P<0.05 vs non-metastatic group.

2.2 LncRNA-H19的表達量在肺腺癌細胞中高于正常肺支氣管上皮細胞qRT-PCR檢測LncRNA-H19在正常肺支氣管上皮細胞BEAS-2B，肺腺癌細胞A549及NCI-H1299中的表達量。如Fig 2所示，與BEAS-2B相比，LncRNA-H19在A549及NCI-H1299中的表達量均明顯升高，并且NCI-H1299中LncRNA-H19的表達量高于A549(P<0.05)。

Fig 2 The relative expression of LncRNA-H19 in BEAS-2B,A549 and NCI-H1299 n=3)*P<0.05 vs BEAS-2B group.

2.3 敲減或過表達肺腺癌細胞中的LncRNA-H19由于LncRNA-H19在NCI-H1299中的表達量高于A549，我們分別對NCI-H1299及A549轉染敲減或過表達質粒，并應用qRT-PCR檢測轉染效率。如Fig 3所示，轉染敲減質粒的NCI-H1299細胞中 LncRNA-H19的表達量明顯降低，與之相反，LncRNA-H19在轉染過表達質粒的A549細胞中顯著升高，表明轉染成功(P<0.05)。

Fig 3 The relative expression of LncRNA-H19 in different A：Expression of LncRNA-H19 in A549 cells,A549/NC and A549/LncRNA-H19 cells；B：Expression of LncRNA-H19 in NCI-H1299 cells,NCI-H1299/Si-NC and NCI-H1299/Si-LncRNA-H19 cells.*P<0.05 vs A549/NC cells.#P<0.05 vs NCI-H1299/Si-NC group.

2.4 LncRNA-H19促進肺腺癌細胞的增殖能力通過CCK-8增殖實驗檢測敲減或過表達LncRNA-H19對肺腺癌細胞增殖能力的影響，如Fig 4所示，與A549組及A549/NC組相比，A549/LncRNA-H19組隨時間增加吸光度明顯升高，表明該組增殖能力升高，而NCI-H1299/Si-LncRNA-H19組吸光度相較NCI-H1299組及NCI-H1299/Si-NC組明顯降低，表明增殖能力受到抑制(P<0.05)。結果表明，LncRNA-H19對肺腺癌細胞的增殖能力有促進作用。

Fig 4 The proliferation ability of lung adenocarcinoma cells A：Relative OD value of indicated groups of A549 cells；B：Relative OD value of indicated groups of NCI-H1299 cells.*P<0.05 vs A549/NC group.#P<0.05 vs NCI-H1299/Si-NC group.

2.5 LncRNA-H19促進肺腺癌細胞的侵襲能力使用Transwell侵襲實驗檢測敲減或過表達LncRNA-H19后肺腺癌細胞侵襲能力的變化，如Fig 5所示，NCI-H1299/Si-LncRNA-H19組穿過小室基質膠的細胞數比NCI-H1299/Si-NC組及NCI-H1299組顯著減少，而A549/LncRNA-H19組與A549/NC組及A549組相比，細胞數則明顯增加(P<0.05，差異具有統計學意義)。實驗表明，LncRNA-H19對肺腺癌細胞的侵襲能力有促進作用。

Fig 5 The cell invasion of lung adenocarcinoma cells after A：Cells that invaded through chamber membrane of indicated groups；B：Relative invasion rate of indicated groups.*P<0.05 vs A549/NC group.#P<0.05 vs NCI-H1299/Si-NC group.

2.6 LncRNA-H19促進肺腺癌細胞的上皮-間質轉化Western blot檢測敲減或過表達LncRNA-H19對上皮-間充質轉化標記物E-cadherin、Vimentin在肺腺癌細胞中表達量的影響。如Fig 6所示，與NCI-H1299/Si-NC相比，NCI-H1299/Si-LncRNA-H19細胞中E-cadherin的表達明顯升高，而Vimentin的表達明顯降低；而與A549/NC相比，A549/LncRNA-H19 細胞中的E-cadherin的表達明顯降低，而Vimentin的表達明顯升高(P<0.05)。實驗表明，LncRNA-H19可促進肺腺癌細胞的上皮-間充質轉化。

Fig 6 The relative expression of EMT markers of different lung adenocarcinoma A：E-cadherin and Vimentin expression of indicated groups of A549 cells；B：E-cadherin and Vimentin expression of indicated groups of NCI-H1299 cells.*P<0.05 vs A549/NC group.#P<0.05 vs NCI-H1299/Si-NC group.

3 討論

LncRNA-H19的表達上調見于乳腺癌[10]，大腸癌[11]等多種癌癥。研究顯示，LncRNA-H19的高表達與晚期非小細胞肺癌腫瘤(TNM)分期及腫瘤大小呈正相關[12]。本研究檢測了LncRNA-H19在伴或不伴淋巴結轉移的肺腺癌組織中的表達情況，發現LncRNA-H19在伴有淋巴結轉移的肺腺癌組織中的表達顯著高于不伴淋巴結轉移的肺腺癌組織，而LncRNA-H19在肺腺癌細胞中的表達亦明顯高于人正常肺支氣管上皮細胞。CCK-8實驗及Transwell實驗顯示，過表達LncRNA-H19可促進肺腺癌細胞的增殖、侵襲能力，而敲低LncRNA-H19則抑制肺腺癌細胞的增殖、侵襲能力。

有關LncRNA的研究日益增多，它們在表觀遺傳、轉錄和轉錄后水平上起作用，是包括細胞生長、凋亡和轉移在內的病理生理關鍵通路的調節因子[13]。肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因，LncRNA參與了肺癌發生的許多方面，諸如調節細胞增殖、干細胞維持、EMT等基本的細胞過程，同時也作為信號轉導的重要角色[14]。LncRNA-H19可通過抑制miR-196b在加速肺癌生長過程中誘導LIN28B表達[15]。本研究通過Western blot實驗檢測肺腺癌細胞中LncRNA-H19對EMT標志物E-cadherin、Vimentin的影響，發現敲減細胞中的LncRNA-H19后，上皮標志物E-cadherin蛋白的表達明顯升高，而間充質標志物Vimentin蛋白的表達明顯降低，而過表達細胞中的LncRNA-H19后E-cadherin及Vimentin的變化與之相反。

綜上所述，LncRNA-H19在伴有淋巴結轉移的肺腺癌組織中的表達高于不伴淋巴結轉移的肺腺癌組織，并且LncRNA-H19可促進肺腺癌細胞的增殖、侵襲及EMT。然而仍需擴大樣本量及進一步的體內實驗進行驗證，我們將深入探究LncRNA-H19參與侵襲轉移的分子機制及其可能調控的靶基因，以尋找更有效的標志物，使肺腺癌診斷治療的理論基礎更加完善。