FKBP38蛋白對人源子宮內膜癌細胞增殖及侵襲的調控

閆云靜，王 帥，穆云萍，賴姨梅，李芳紅

(1.廣東工業大學生物醫藥學院，廣東 廣州 510006；2.贛南醫學院第一附屬醫院病理科，江西 贛南 341000)

子宮內膜癌(endometrial carcinoma，EC)是源于子宮內膜上皮的婦科惡性腫瘤，其發病率在女性腫瘤中位于第六位[1]。如能早期診斷，子宮內膜癌病人具有良好的預后結果，但仍有15%～25%患者就診時已是晚期，診斷晚期或復發病例的中位生存時間不超過1年[2]。因此，對于EC的篩查、診斷以及治療的分子新靶點及機制的研究尚有許多問題有待解決。

FK506結合蛋白38(FK506-bindingprotein 38，FKBP38)作為免疫親和素的一員，與癌癥發生可能有密切關系。FKBP38是哺乳動物的雷帕霉素靶標(mammalian target of rapamycin，mTOR)內源性抑制劑，可通過與mTOR 相結合來抑制mTOR的下游通路[3]。研究表明[4]，在高轉移乳腺癌細胞4T1及黑色素瘤細胞B16-F10中，FKBP38發揮著抑制腫瘤轉移的作用。此外，前期研究發現，FKBP38蛋白與多種癌癥發生發展具有一定相關性[5-6]，進一步表明FKBP38蛋白可能在抑制癌細胞增殖活性或抑制細胞轉移等方面發揮著重要作用。

本研究首次檢測了不同分級、不同分期子宮內膜癌細胞中FKBP38蛋白表達水平變化，并通過在細胞水平過表達FKBP38研究其對子宮內膜癌細胞AN3Ca的影響。為進一步探討FKBP38對于癌癥的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞及病毒 人源子宮內膜癌細胞Ishikawa(Grade 1)，RL95-2,Hec-1-A，Hec-1-B(Grade 2),AN3Ca (Grade 3) 均購美國細胞研究庫(American Type Culture Collection,ATCC)。FKBP38過表達慢病毒載體購自廣州賽業公司，慢病毒載體為LV-EF1a>hFKBP38 [NM-012181.4]-CMV>eGFP/T2A/Puro 和LV-CMV>eGFP/T2A/Puro(以下分別標為FKBP38及Vector)。慢病毒中包括FKBP38全長cDNA，所有結構都經DNA測序驗證，轉染效果經實時定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)及免疫印跡(Western blot)驗證。

1.1.2試劑 RPMI1640(Lot:1976019)，DMEM(Lot:2105326)，DMEM-F12(1973914)，McCoy’s 5A(Lot:SLBN4158V)，胎牛血清和胰酶(Lot:2120649)均購自美國Gibco公司，E.Z.N.A.Total RNA KitⅠ購自美國OMEGA公司，ProteinK選自美國Sigma 公司，Power SYBR Green PCR Master Mix選自Vazyme公司。Pierce BCA Protein Assay Kit選自美國Thermo公司，引物由上海生工生物有限公司合成。FKBP38、蛋白激酶B( Protein kinase B,Akt)、核糖體蛋白S6( Ribosomalprotein S6，S6)抗體購自R&D 公司，真核起始因子4E結合蛋白1(Eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1,P-4E-BP1)、P-4E-BP1、p-Akt、P-S6抗體購自CST公司。Edu檢測試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司。Transparent PET Membrane 24 Well 8.0 μm pore size及 Invasion Chambers with 8.0 μm PET Membrane in two 24 Well Plates 購自美國Corning公司。

1.1.3儀器 AC2-4S1型二級生物安全柜(ESCO，新加坡)；CLM-170B-8-NF型二氧化碳培養箱(ESCO，新加坡)；TDZ5-WS型多管架自動平衡離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；ChemiDoc+XRS化學發光凝膠成像系統(Bio-Rad，美國)；Leica倒置顯微鏡(Leica德國)；CMAXPLUS+酶標儀(美國)；-80 ℃冰箱(中國美菱)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 Ishikawa細胞于RPMI 1640+10%FBS培養基進行培養，RL95-2細胞于DMEM+10%FBS培養基進行培養，Hec-1-A細胞于McCoy＇s 5A+10%FBS培養基進行培養，Hec-1-B細胞于DMEM-F12+10%FBS培養基進行培養，AN3Ca細胞于MEM+10%FBS培養基培養，所有細胞均于37 ℃，5% CO2培養箱培養。待細胞長至培養皿70%～80%進行傳代。

1.2.2細胞分組及感染 將AN3Ca細胞分為對照組(Vector)及過表達FKBP38組(FKBP38)，將細胞接種于6孔板，待細胞長于60%時進行病毒感染實驗，收集細胞抽提RNA及蛋白進行RT-PCR及Western blot檢驗病毒干擾效率。

1.2.3細胞mRNA水平檢測 將培養的子宮內膜癌細胞利用E.Z.N.A.Total RNA Kit試劑盒提取RNA，再通過逆轉RNA得到cDNA，Vazyme公司的Power SYBR Green PCR Master Mix為體系對相應的目的基因進行進行RT-RCR。FKBP38 上游引物：5′-TCCAGCGCCAAAGTG GACAT-3′,下游引物：5′-GAGCTCTGCGTGGATCG TCT-3′;β-actin上游引物:5′-GATTACTGCTCTGGC TCCTAGC-3′,下游引物：5′-GACTCATCGTACTCCTG CTTGC-3′。

1.2.4細胞蛋白水平檢測 取10 cm細胞培養皿加入100 μL添加有PMSF的RIPA裂解液，用無菌細胞刮刮下，于95 ℃金屬浴變性5 min，超聲破碎，12 000 r·min-1離心5 min取上清，將提取的蛋白用BCA測濃度，Western blot檢測各細胞中FKBP38表達。

1.2.55-乙炔基-2′-脫氧尿苷(5-Ethynyl-2′-deoxyuridine,Edu)檢測細胞增殖 將細胞消化制成細胞懸液，將細胞以1 000/孔的密度均勻加入96孔板,48 h后根據Edu檢測試劑盒說明書進行Edu染色，熒光倒置顯微鏡檢測細胞染色情況并進行拍照統計。

1.2.6平板克隆實驗 將AN3Ca細胞以600個/孔密度均勻鋪于35 mm培養皿，每孔加入2 mL培養基，放于37 ℃細胞培養箱培養10 d，10 d后去除上清，每孔加入800 μL 4%多聚甲醛固定15 min，結晶紫染色10 min，無菌水洗3遍去除背景色，晾干統計形成克隆的數目，實驗重復3遍。

1.2.7Transwell小室實驗[7]取對數生長期細胞換為無血清培養基進行饑餓10 h，10 h后制成細胞懸液。遷移實驗：細胞計數，AN3Ca細胞以1.5×105密度加入Tranwell 小室上室中，下室中加入800 μL含20%FBS培養基，37 ℃培養箱培養24 h。侵襲實驗：將凍存于-20 ℃帶有Matrigel膠小室提前2 h放于37 ℃融化，細胞計數，AN3Ca細胞以2×105密度加入帶有基質膠的小室上室中，下室中加入800 μL含20%FBS完全培養基，37 ℃培養箱培養24 h。24 h后取出上層小室，棄內側廢液，用棉簽輕輕擦拭微孔膜內側，PBS清洗內側3遍，4%多聚甲醛固定150 min，結晶紫染色10 min，清洗，倒置晾干，于倒置顯微鏡下觀察拍照。

2 結果

2.1 不同病理分級子宮內膜癌細胞中FKBP38表達情況Realtime quantitative PCR(RT-qPCR)結果顯示(Fig 1A)，與病理分級較低Ishikawa細胞相比，Hec-1-A、Hec-1-B、RL95-2及AN3Ca病理分級較高子宮內膜癌細胞中FKBP38 mRNA表達較低，對比Ishikawa細胞，差異具有統計學意義(P<0.01)。此外，Western blot檢測FKBP38蛋白的結果顯示相同趨勢(Fig 1B)。實驗表明不同病理分級子宮內膜癌細胞中FKBP38表達不同，并且隨著病理分級的增加，FKBP38表達量降低。

Fig 1 FKBP38 expression in each group of five human endometrial cancer cellsA：The mRNA expression in five endometrial cancer cell lines Protein levels in five endometrial cancercell lines.**P<0.01 vs Ishikawa

2.2 穩定過表達FKBP38的子宮內膜癌細胞株的建立利用攜帶FKBP38的病毒感染人子宮內膜癌細胞AN3Ca。隨后，我們利用RT-qPCR手段檢測FKBP38的表達水平。結果顯示(Fig 2)，與對照病毒感染組相比，FKBP38過表達病毒使AN3Ca細胞中FKBP38的mRNA水平升高(P<0.01)。Western blot檢測兩組中FKBP38蛋白的結果與RT-qPCR分析的結果相符，即在AN3Ca細胞中感染過表達FKBP38病毒后，FKBP38蛋白水平上調。以上結果表明穩定過表達FKBP38的AN3Ca細胞株構建成功。

Fig 2 FKBP38 expression in vector and FKBP38 overexpression groupsA：The mRNA expression in Vector and FKBP38 ；B：Protein levels in Vector and FKBP38.**P<0.01 vs vector

2.3 FKBP38對子宮內膜癌細胞體外增殖能力影響Edu實驗結果顯示，過表達FKBP38后AN3Ca細胞增殖能力降低(P<0.01)(Fig 3)，結果表明，過表達FKBP38可抑制子宮內膜癌細胞AN3Ca體外增殖活力。

Fig 3 Effect of FKBP38 over expression on cell proliferation of AN3Ca vs vector

平板克隆實驗可檢測細胞增殖能力及群體依賴性。Fig 4實驗結果顯示，與Vector相比，AN3Ca細胞過表達FKBP38后細胞克隆的數目明顯減少(P<0.01)。實驗進一步表明FKBP38可抑制子宮內膜癌細胞AN3Ca的增殖能力。

Fig 4 Effect of FKBP38 over expression on plate colony assay of AN3Ca cells n=3)**P<0.01 vs vector

2.4 FKBP38對子宮內膜癌細胞遷移及侵襲能力影響通過(無/有)基質膠的Transwell小室檢測過表達FKBP38后子宮內膜癌細胞AN3Ca的遷移及侵襲能力變化，Fig 5結果顯示，過表達FKBP38后細胞穿過微孔膜的細胞個數顯著減少(P<0.01)。以上實驗表明，FKBP38可抑制子宮內膜癌細胞AN3Ca的遷移及侵襲能力。

Fig 5 Effect of FKBP38 over expressionon migration(A) andinvasion (B) of AN3Ca cells n=3)**P<0.01 vs vector

2.5 FKBP38過表達對子宮內膜癌細胞AN3CAmTOR通路影響通過Western blot檢測子宮內膜癌細胞AN3CA過表達FKBP38對mTOR通路的影響，結果表明，細胞過表達FKBP38后P-S6、P-4E-BP1、4E-BP1蛋白無明顯變化，但S6總蛋白表達增加(Fig 6)。這提示子宮內膜癌細胞中可能存在反饋系統，在細胞S6相對磷酸化水平降低時通過過表達S6總蛋白來增加P-S6含量。此外，過表達FKBP38蛋白可降低Akt蛋白磷酸化水平，說明FKBP38蛋白可能是通過調控Akt磷酸化水平來調控信號通路。

Fig 6 Effect of FKBP38 over expression on mTOR pathway of AN3Ca cells

3 討論

子宮內膜癌是最常見的女性生殖系統的惡性腫瘤，其死亡率僅次于宮頸癌[1]。子宮內膜癌的治療主要是通過手術切除子宮、卵巢、輸卵管或輔以化療。為更好評估子宮內膜癌的生物學個體疾病行為并最終改善治療決策和結果，領域內專家已提出將分子特征與子宮內膜癌分類及風險評估結合起來[8]。其中包括磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidyli-nositol 3-kinase，PI3K)/Akt/mTOR、RAS-RAF-MEK-ERK 等信號通路。其中mTOR通路為關鍵性通路之一。mTOR是細胞生長增殖的中心調控分子。mTOR存在兩種生化和功能不同的復合物，mTORC1和mTORC2，其中mTORC1通過作用于底物核糖體S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase beta-1，S6K1)和4E-BP1的磷酸化水平來調節細胞生長和增殖。mTORC2可通過磷酸化Akt來調控Akt的活性[9]。

mTOR通路在多種腫瘤類型(包括子宮內膜癌)的發生發展中起關鍵作用[10]。研究發現骨化三醇聯合雷帕霉素可協同抑制人子宮內膜癌細胞株Ishikawa的增殖[11]，臨床研究表明，mTOR抑制劑在子宮內膜癌中表現出臨床活性，抑制mTOR通路可能是一個可行的治療靶點[12]。前期的文獻報道中已經證明，FKBP38蛋白是通過結合Rheb1從而成為mTOR內源性抑制劑，也可與mTOR以類似FKBP12-mTOR結合方式結合從而抑制mTOR的活性[9]。另外，FKBP38為線粒體膜蛋白，可招募BCL-2至線粒體上抑制凋亡[13]。FKBP38在多種癌組織中均有不同程度的下調，說明FKBP38可能在抑制癌細胞增殖的過程中發揮著重要作用[6]。此外Sylvia Fong等[4]發現FKBP38可抑制乳腺癌細胞4T1 及黑色素瘤細胞B16-F10轉移能力，進一步表明FKBP38可能與癌細胞增殖或轉移相關。

為研究FKBP38對子宮內膜癌細胞增殖及侵襲的影響，本實驗檢測了不同分級的子宮內膜癌細胞中FKBP38表達水平,并通過過表達FKBP38來檢測其對于子宮內膜癌細胞的影響。我們的研究結果發現，不同病理分級，不同分期子宮內膜癌細胞中FKBP38表達不同，隨著病理分級升高FKBP38表達水平逐漸降低。為研究不同病理分級子宮內膜癌細胞FKBP38的表達，我們選取了5株不同病理分級的子宮內膜癌細胞進行研究。為進一步研究FKBP38對于子宮內膜癌的影響，我們選取FKBP38表達量顯著降低的子宮內膜癌細胞系，AN3Ca，來過表達FKBP38檢測其表型變化。在子宮內膜癌細胞AN3Ca中過表達FKBP38后發現細胞增殖活力顯著降低，說明FKBP38可能在子宮內膜癌發生發展過程中發揮著抑制細胞增殖的作用。雖然這可能與前期研究中FKBP38可招募Bcl-2至線粒體抑制凋亡作用相矛盾，但Huang等[14]指出，死亡的腫瘤細胞可利用凋亡過程產生強有力的生長刺激信號，以刺激腫瘤細胞的再生，表明某一基因可能同時存在增強細胞增殖及凋亡的作用。此外，本研究發現FKBP38可有效抑制AN3Ca細胞的遷移及侵襲能力。為研究FKBP38對于子宮內膜癌細胞AN3Ca細胞的作用機理，我們檢測mTORC1的直接下游底物，通過驗證S6和4EBP-1 的磷酸化水平來間接地驗證mTOR 的激活水平，此外，我們還檢測mTOR的重要調控靶點Akt的磷酸化水平。

綜上表明，子宮內膜癌細胞AN3Ca過表達FKBP38后，mTOR下游基因S6磷酸化水平對比對照組無明顯變化，但S6總蛋白表達增加，這提示我們子宮內膜癌細胞中可能存在反饋系統，在細胞S6相對磷酸化水平降低時通過過表達S6總蛋白來增加P-S6含量。4E-BP-1磷酸化水平無明顯變化，提示我們在子宮內膜癌中FKBP38可能未通過調節4E-BP-1蛋白表達來調節子宮內膜癌細胞增殖、侵襲等生理活動。此外，Akt的磷酸化水平降低，表明過表達FKBP38蛋白可降低Akt蛋白磷酸化水平。但是FKBP38下調Akt的信號通路機制有待進一步研究。