艾葉提取物對凝血因子Ⅻ的作用機制和藥效物質(zhì)研究

王珊珊，徐 昊，陳 青，譚開云，凌 云，葛金文，

(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 1.中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208，2.第一附屬醫(yī)院醫(yī)務(wù)科，湖南 長沙 410008；3.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長沙 410208)

血栓性疾病包括缺血性腦卒中、心肌梗塞、下肢深靜脈血栓等。在中國，40歲以上中風(fēng)患病率為2.21%，其中IS占病例總數(shù)的69.6%～70.8%[1-2]。隨著血栓性疾病發(fā)病率的日益增加，呈年輕化趨勢，其發(fā)病機制和新的防治藥物開發(fā)仍是研究的熱點。

目前認(rèn)為，血栓性疾病是血栓形成與炎癥反應(yīng)互為因果的惡性循環(huán)結(jié)果。其中，凝血因子Ⅻ(coagulation factor Ⅻ，F(xiàn)Ⅻ)是一個關(guān)鍵的蛋白。其作為內(nèi)源性凝血系統(tǒng)的啟動蛋白，無論是先天缺陷者還是基因工程鼠均提示其未參與正常的生理止血過程。又由于在腦缺血模型和深靜脈血栓模型中，基因敲除FⅫ的工程鼠造模處表現(xiàn)出更不明顯的血凝塊生成，因此，認(rèn)為FⅫ與血栓性疾病密切相關(guān)。然而，進一步的研究提示FⅫ對血栓形成的作用與其特殊蛋白結(jié)構(gòu)有關(guān)[3-4]，但其機制并不明確。

艾葉為菊科植物艾ArtemisiaargyiLevl.et Vant.的干燥葉，《本草綱目》記載其具有“溫中、逐冷、除濕”的作用。《本草從新》中將其功效拓展為“逐寒濕，暖胞宮，止諸血，溫中開郁，調(diào)經(jīng)安胎”。盡管醫(yī)書記載和現(xiàn)代藥理研究均表明艾葉有止血功效，但臨床上，艾葉除了用于小的外傷止血外，還廣泛應(yīng)于血栓性疾病后遺癥期和淤血疼痛患者中，以幫助病人緩解癥狀、恢復(fù)功能。大量動物基礎(chǔ)研究顯示，艾葉在體內(nèi)、外實驗中均表現(xiàn)出抗凝、止血、活血的調(diào)節(jié)效應(yīng)，其可能與特殊的炮制手段密切相關(guān)[5-6]。這種抗凝、促凝的雙向調(diào)節(jié)作用可能有利于治療血栓性疾病而不引起不可控出血的發(fā)生。本課題組前期研究也證實，在體外實驗中，艾葉提取物有效縮短了健康人血漿復(fù)鈣時間，其主要與FⅫ激活有關(guān)[7]，而艾葉對FⅫ的激活位點目前并不清楚。同時，前期研究還發(fā)現(xiàn)，盡管艾葉提取物有促凝活性，但其明顯延長了健康人和新西蘭白兔血漿的活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)，提示該提取工藝下可能存在抗凝、促凝兩種物質(zhì)，基于此，本研究通過檢測艾葉提取物對腦缺血病人血漿凝血的影響、對FⅫ的激活作用，同時，對該種提取工藝的艾葉提取物進一步分離，對不同提取組分的活性作用進行研究，試圖闡明其促凝、抗凝的所用機制及其可能的活性物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材干艾葉 1 kg(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房提供);缺乏FⅫ人血漿(113406，STAGO，法國)、APTT(114145，STAGO，法國)、凝血酶原時間(prothrombin time,PT，112978，STAGO，法國)、凝血酶時間(thrombin time,TT，113668，STAGO，法國)、纖維蛋白原(fibrinogen,FIB，119255，STAGO，法國)、His標(biāo)簽抗體(CST，12698P)、鼠抗羊熒光二抗(Abcam,ab6785)。

1.2 血漿制備腦缺血病人全血(納入標(biāo)準(zhǔn)：45～65歲，以腦缺血急性發(fā)病期為診斷，無阿司匹林、華法林等抗凝藥物服用史，臨床暫未使用抗凝、溶栓藥物處理的入院首次抽血)來源于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科。于湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治實驗室離心制備成血漿。

1.3 FⅫ、FⅫ-2蛋白制備FⅫ全長載體，F(xiàn)Ⅻ-2突變載體構(gòu)建于上海吉滿公司。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、慢病毒制備、轉(zhuǎn)入HEK293細胞，提取細胞上清液，上樣His-tag柱，5%咪唑洗脫，得到純化FⅫ、FⅫ-2蛋白。

1.4 艾葉提取物制備取1 kg干燥艾葉，制備為終濃度1 mg·L-1的艾葉提取物，C18柱分離層析艾葉提取物，分別用超純水、10%、30%、50%、70%、100%甲醇洗脫、烘干。在每個組分中加入5 mL超純水溶解樣本，編號LODB1、LODB2、LODB3、LODB4、LODB5、LODB6。

1.5 艾葉提取物體外凝血實驗取腦缺血病人血漿與125 g·L-1的艾葉提取物1 ∶1充分混勻后檢測凝血4項(APTT、PT、TT、FIB)及FⅫ活性，記錄數(shù)值。

1.6 艾葉提取物干預(yù)凝血因子活性實驗參照文獻處理[8]，取45 μL FⅫ-2純化蛋白分別與45 μL超純水、高嶺土試劑(FⅫ特異性激活劑)、0.062 5、0.125、0.25、0.5 mg·L-1艾葉提取液混合，編號：陰性對照組、陽性對照組、FⅫ(FⅫ-2)低(8 ∶1)、中(4 ∶1)、高(2 ∶1)、超高劑量(1 ∶1)艾葉組。37 ℃孵育5 min，10 000 r·min-1離心5 min，進行Western blot實驗，檢測灰度值。

1.7 艾葉分離成分活性實驗取腦缺血病人血漿分別與0.125 mg·L-1的LODB1、LODB2、LODB3、LODB4、LODB5、LODB6，充分混勻后檢測APTT、PT、TT，記錄數(shù)值。

取45 μL FⅫ純化蛋白分別與45 μL超純水、高嶺土試劑、終濃度為0.125 mg·L-1LODB1-6混合，編號：空白組、高嶺土組、LODB1組、LODB2組、LODB3組、LODB4組、LODB5組、LODB6組。37 ℃孵育5 min，10 000 r·min-1離心5 min，進行Western blot實驗，檢測灰度值。

取45 μL FⅫ純化蛋白分別與45 μL超純水、高嶺土試劑、終濃度分別為0.012 5、0.062 5、0.031 3、0.015 6 mg·L-1的LODB5或LODB6混合，編號：陰性對照組、陽性對照組、LODB5(LODB6)高劑量組、LODB5(LODB6)中劑量組、LODB5(LODB6)低劑量組、LODB5(LODB6)超低劑量組。37 ℃孵育5 min，10 000 r·min-1離心5 min，進行Western blot實驗，檢測密度值。

1.8 艾葉有效成分分析實驗將艾葉提取液LODB5過濾除雜。以流動相水 ∶乙腈=90 ∶10的條件上樣5 μL樣本入超高效液相-質(zhì)譜(LC-MS)跑樣20 min，洗柱保存數(shù)據(jù)。比對Batman數(shù)據(jù)庫及有關(guān)文獻報道的艾葉提取液已知的單體成分，分析推斷可能的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2 結(jié)果

2.1 艾葉提取物對腦缺血病人凝血功能的影響如Fig 1所示，艾葉提取物延長了腦缺血病人血漿PT、APTT、TT時間，差異有顯著性(P<0.01)，但其不影響纖維蛋白含量，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。此外，艾葉提取物降低了FⅫ活性，差異有顯著性(P<0.01)，提示艾葉提取物抑制了高嶺土對FⅫ的激活。

Fig 1 Intervention effect of Artemisia argyi extract on blood coagulation and factor activity in plasma of patients *P<0.05,**P<0.01 vs control

2.2 艾葉提取物對不同結(jié)構(gòu)的凝血因子(Ⅻ)蛋白活性的干預(yù)作用如Fig 2所示，在FⅫ蛋白激活實驗中，相比于空白組，艾葉低、中、高、超高劑量組的FⅫ密度值明顯降低，差異有顯著性(P<0.01)；在FⅫ-2激活實驗中，相比于空白組，艾葉中、高劑量組的FⅫ-2密度值明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，在相同艾葉提取物劑量下，相比于FⅫ，在艾葉低、中、高、超高劑量組的FⅫ-2密度值明顯高于FⅫ，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示了艾葉對FⅫ的激活強于對FⅫ-2。

Fig 2 Activation of FⅫ and FⅫ-2 in Artemisia argyi extract *P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05 vs FⅫ

2.3 艾葉提取物不同組分對凝血功能的干預(yù)作用如Fig 3所示，在腦缺血病人血漿中，相比于空白組，LODB1組、LODB2組、LODB3組的APTT、PT、TT值沒有明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。LODB4組的APTT值延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。LODB5組的APTT、PT、TT均有明顯延長，其中APTT延長最為明顯，差異有顯著性(P<0.01)。在連續(xù)監(jiān)測血漿凝固實驗中，LODB6的OD值從第5 min起即明顯增加，差異有顯著性(P<0.01)。

Fig 3 Intervention effect of LODB1-LODB6 on blood coagulation in plasma of patients with *P<0.05,**P<0.01 vs LODB1.

2.4 艾葉不同組分對FⅫ的激活作用Fig 4所示，LODB1，LODB2、LODB3對FⅫ的密度值沒有明顯影響，無統(tǒng)計學(xué)意義。而LODB4組、LODB5組、LODB6組明顯降低了FⅫ的密度值，差異有顯著性(P<0.01)，其中LODB6組減少得最為明顯，提示LODB4-6對FⅫ有激活作用。

Fig 4 Activation of FⅫ in LODB1-LODB6 *P<0.05 vs control.

2.5 艾葉提取物L(fēng)ODB5成分分析如Fig 5所示，在LC-MS檢測中，共發(fā)現(xiàn)17種主要物質(zhì)，通過Batman數(shù)據(jù)庫，并結(jié)合目前文獻報道對已知艾葉90種成分進行比較，得到分子量相近的6種含量較高化合物，如Tab 1所示，分別為：異戊酸冰片酯、棕矢車菊素、5,6,4′-三羥基-7,3′-二甲氧基黃酮、傘形花內(nèi)酯、丁香酚、紫花牡荊素。

Fig 5 Liquid chromatography-mass spectrometry analysis of LODB5

Tab 1 Substances 'molcular and structural characteristic of LODB5 n=3)

3 討論

IS是一種典型的動脈血栓性疾病，其高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率使得其一直是研究的熱點。盡管抗凝新藥日益增多，但其主要針對凝血酶及FⅩa產(chǎn)生抑制或滅活，不可控出血一直是難以解決的副作用[3]導(dǎo)致臨床運用受限。

艾葉相比與臨床常用的抗凝藥物，如阿司匹林、華法林等其優(yōu)勢在于不會引起不可控出血。本項目組前期在正常人和兔血漿中發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過一系列提取工藝后，艾葉提取物對兔血漿具有促凝-活血雙向調(diào)節(jié)作用，但其機制仍未能闡明。基于此，本項目在腦缺血病人血漿基礎(chǔ)上進一步開展了相關(guān)研究，試圖闡明其對FⅫ的作用機制及其可能的物質(zhì)基礎(chǔ)。

本課題前期在健康人血漿中確定了該種提取工藝下的艾葉提取物具有促凝-活血雙向調(diào)控藥效作用，其有效延長了人血漿PT、APTT時間。為研究其變化規(guī)律，對57例IS病人的凝血功能和因子活性也進行了分析，結(jié)果顯示腦缺血病人血漿的凝血功能和因子活性與健康人相比，雖然整體統(tǒng)計學(xué)上沒有意義，但卻有更大的波動，提示了腦缺血病人有不同程度的凝血因子功能紊亂。因此，本項目針對腦缺血病人進一步驗證艾葉提取物的作用，得到了與健康人一致的結(jié)果。提示該種艾葉提取物對內(nèi)源性凝血和外源性凝血途徑均有明顯的抑制作用，其很可能作用于凝血通路的共同途徑，即FⅩ(a)、凝血酶(原)和纖維蛋白(原)。在TT、FIB、FⅩ活性實驗中，艾葉提取物還明顯延長TT，但對FⅩ沒有影響，也不會導(dǎo)致FIB的減少，因此，本項目推測其抗凝藥效作用是限制了凝血酶活性。然而，艾葉提取物對APTT的作用更明顯，這可能是因為艾葉提取物和高嶺土間可能存在競爭性抑制關(guān)系，導(dǎo)致高嶺土激活作用被艾葉提取物取代，而艾葉提取物對FⅫ的激活較高嶺土更緩而溫和，從而，導(dǎo)致了APTT的明顯延長的原因。FⅫ特殊的蛋白結(jié)構(gòu)使其有不同的激活位點，不同位點的激活的FⅫ對下游底物有不同的激活效應(yīng)[9-10]。為了檢測艾葉提取物對FⅫ的作用位點，本項目通過截斷FⅫ的EGF-Like2結(jié)構(gòu)域，合成了缺EGF-Like2的FⅫ-2截短蛋白。結(jié)果顯示，在相等濃度下，艾葉提取物對FⅫ-2的激活效應(yīng)明顯弱于對FⅫ，提示艾葉提取物中的有效成分對FⅫ的激活位點可能位于FⅫ的EGF-Like2結(jié)構(gòu)域上。

艾葉含有揮發(fā)油、黃酮類、鞣酸類、桉葉烷類、三萜類等多種成分[11]，因此，關(guān)于艾葉的凝血-抗凝血雙向調(diào)節(jié)作用很多研究者認(rèn)為與艾葉的成分密切相關(guān)。例如，鞣酸類就是最強的促凝物質(zhì)，而萜類、黃酮類物質(zhì)是艾灸與擦劑的主要藥物成分，有通經(jīng)活絡(luò)，化瘀活血之功，其中，5,6,2′，4′-四羥基-7,5′-二甲氧基黃酮和eupatilin 7-O-β-d-吡喃葡糖苷就可明顯延長TT時間[12]。

在各組分活性實驗中，本項目組發(fā)現(xiàn)50%～100%甲醇組分中包含著關(guān)鍵的活性物質(zhì)。其中，70%甲醇提取組分(LODB5)有明顯的抗凝效應(yīng)，顯著延長了健康人血漿APTT、PT、TT提示其可能含有抑制凝血酶活性的成分。而100%甲醇提取組分(LODB6)雖然對APTT、PT、TT沒有影響，但在連續(xù)血凝檢測中，在沒有CACl2的條件下，LODB6即有顯著凝血反應(yīng)，導(dǎo)致了纖維蛋白的持續(xù)性生成。提示其可能含有激活FⅫ的物質(zhì)。在FⅫ激活實驗中，高濃度的LODB5對FⅫ也有激活效應(yīng)，提示了LODB5是艾葉提取物凝血-抗凝血的關(guān)鍵的組分。通過LC-MS分析，本項目組在LODB5中發(fā)現(xiàn)了6種主要物質(zhì)，這可能與艾葉提取液的雙向調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

艾葉提取物可激活FⅫ產(chǎn)生促凝活性，該作用與其EGF-Like2結(jié)構(gòu)域有關(guān)。但艾葉提取物對腦缺血病人血漿整體表現(xiàn)出抗凝活性。其促凝、抗凝的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)可能是異戊酸冰片酯、紫花牡荊素、棕矢車菊素、傘形花內(nèi)酯、5,6,4′-三羥基-7,3′-二甲氧基黃酮、丁香酚。