沒(méi)食子酸在Caco-2細(xì)胞模型中的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)研究

程珍珍，周本宏,，姜 姍，金 丹

(1.武漢大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430072；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430060)

石榴皮是石榴科植物石榴PunicagranatumL.的干燥果皮，是一種常見(jiàn)的中藥，具有止血、驅(qū)蟲(chóng)、澀腸止瀉的功效[1]。沒(méi)食子酸是石榴皮中沒(méi)食子鞣質(zhì)的重要生物活性成分之一，是結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單的天然多酚物質(zhì)[2]。沒(méi)食子酸具有抗肝纖維化、抗糖尿病、抗腫瘤等作用[3-4]。Caco-2細(xì)胞是來(lái)源于人類(lèi)結(jié)腸直腸癌，Caco-2細(xì)胞模型被廣泛地用于評(píng)估藥物腸道吸收特征和研究藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收[5-6]。目前對(duì)沒(méi)食子酸的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及其影響轉(zhuǎn)運(yùn)的因素研究甚少。因此，本研究建立Caco-2細(xì)胞模型，對(duì)沒(méi)食子酸的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收方式以及影響因素進(jìn)行研究，以初步闡明沒(méi)食子酸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料沒(méi)食子酸對(duì)照品(成都曼斯特，批號(hào)：16022801，純度99%);細(xì)胞 Caco-2細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，代數(shù)在35～50代。

1.2 色譜條件色譜柱：C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相：有機(jī)相甲醇(A)，水相0.1%磷酸(B)，A ∶B=3 ∶7等度洗脫；流速，1.00 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL檢測(cè)波長(zhǎng)，273 nm。

1.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法；計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4 轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)取培養(yǎng)21 d、TEER值大于500 Ω·cm-2、堿性磷酸酶與酚紅滲透率均達(dá)標(biāo)的Caco-2細(xì)胞，進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。分別測(cè)定時(shí)間、溫度、pH值、P-糖蛋白抑制劑維拉帕米與環(huán)孢菌素對(duì)沒(méi)食子酸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。

1.5 數(shù)據(jù)處理表觀滲透系數(shù)( apparent permeability，Papp) 值和外排率(efflux ratio，ER)值。

式中：A為T(mén)ranswell 小室的有效面積;ΔQ為Δt時(shí)間內(nèi)藥物的累積轉(zhuǎn)運(yùn)量;C0為藥物的初始濃度;Papp(BL-AP)為 BL到AP側(cè)的Papp值;Papp(AP-BL)為AP到BL側(cè)的Papp值。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)如Tab 1，除了250 μmol·L-1外，其余濃度的存活率均超過(guò)95%，表明沒(méi)食子酸對(duì)Caco-2細(xì)胞沒(méi)有毒性。

Tab 1 ytotoxicity of gallic acid at different concentrations

2.2 不同時(shí)間藥物的累積轉(zhuǎn)運(yùn)量沒(méi)食子酸的積累隨著濃度和時(shí)間的增加而增加，呈現(xiàn)出近似線性的關(guān)系，說(shuō)明沒(méi)食子酸的膜吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)都涉及被動(dòng)擴(kuò)散。

2.3 濃度對(duì)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的影響吸收的Papp(AP-BL)明顯大于排泄Papp(BL-AP)，說(shuō)明當(dāng)GA濃度高于一定值時(shí)，排泄機(jī)制被激活(P<0.05)。

2.4 溫度對(duì)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的影響4 ℃時(shí)，Papp(AP-BL)和Papp(BL-AP)值顯著低于37 ℃(P<0.05)，說(shuō)明溫度對(duì)沒(méi)食子酸的吸收有影響。

2.5 pH值對(duì)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的影響沒(méi)食子酸在pH 6.0的Papp(AP-BL)值高于pH 7.4(P<0.05)，說(shuō)明在pH 6.0時(shí)沒(méi)食子酸的轉(zhuǎn)運(yùn)比在pH 7.4時(shí)更容易。

2.6 P-gp 抑制劑對(duì)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的影響與對(duì)照組相比，P-gp抑制劑維拉帕米和環(huán)孢素A使沒(méi)食子酸的Papp(AP-BL)值顯著升高(P<0.05)，而Papp(BL-AP)值顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明沒(méi)食子酸可能是P-gp的底物。

3 討論

沒(méi)食子酸在Caco-2 細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運(yùn)方式以被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)為主。同時(shí)沒(méi)食子酸在 Caco-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)受濃度、溫度、pH值及P-gp抑制劑的影響，P-gp參與了沒(méi)食子酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究初步闡明了沒(méi)食子酸在Caco-2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及其影響因素，同時(shí)也為沒(méi)食子酸的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。