肺癌患者多周期化療中淋巴細胞亞群數量及 T細胞表面共抑制分子的動態表達研究

吳紅波，穆曉倩，吳慧娟，陳利娟，劉杰，胡秀峰，趙艷秋

河南省腫瘤醫院（鄭州大學附屬腫瘤醫院）呼吸內科，鄭州4500000

肺癌是惡性腫瘤中發病率和病死率最高的腫瘤，2015年中國肺癌病死率為39.81/10萬，病死率高、預后較差[1]，近年來肺癌發病率和病死率均呈逐漸增高的趨勢[2]。非小細胞肺癌是肺癌最常見的類型，發現時多為晚期，對出現淋巴結轉移患者，5年生存率明顯降低[3]。化療是肺癌目前主要的治療方案之一，含鉑的雙藥化療方案是目前的標準治療方案，能提高晚期肺癌患者化療客觀有效率和疾病控制率，延長晚期肺癌患者的無進展生存期[4]。研究表明，化療藥物能明顯影響患者機體免疫功能[5]。肺癌患者的外周血淋巴細胞，如T淋巴細胞等亞群水平對預后具有重要影響，外周血CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4+/CD8+是肺癌患者預后的影響因素[6]。本研究旨在通過分析肺癌多周期化療中外周血淋巴細胞亞群數量變化及T細胞表面共抑制分子變化，了解機體免疫狀態的變化，為臨床個體化的腫瘤免疫治療提供初步的理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年1月至2018年1月于河南省腫瘤醫院就診的肺癌患者的病歷資料。納入標準：①經病理學或細胞學檢查確診為肺癌，既往未行其他腫瘤治療及影響免疫功能的藥物治療；②行為狀態良好，卡氏功能狀態（Karnofsky performance status，KPS）評分≥70分，生存時間大于3個月；③具有計算機斷層掃描（CT）可測量的腫瘤病灶。排除標準：①合并嚴重心、肺、肝、腎等器官功能障礙；②伴有急性感染性疾病或免疫系統疾病；③因化療過程中疾病進展轉二線治療，未完成5個周期化療或失訪。根據納入、排除標準，共納入124例肺癌患者，男性73例，女性51例；年齡37～78歲，中位年齡58歲；肺腺癌63例，鱗狀細胞癌31例，小細胞肺癌30例；I期23例，Ⅱ期16例，Ⅲ期34例，Ⅳ期51例；淋巴結轉移85例，無淋巴結轉移39例。

1.2 化療方法

所有患者均經連續5個周期化療后進行療效評價，化療前及最后一次化療后1個月行CT或磁共振成像（MRI）檢查評價療效，隨時評價不良反應。I期、Ⅱ期和Ⅲ期的73例患者均為術后輔助化療；Ⅳ期51例患者均予以標準化療。化療方案采取含鉑類雙藥化療，非小細胞肺癌采用吉西他濱+順鉑（GP）方案（第1、8天予吉西他濱1000 mg/m2，第1～3天予以順鉑35 mg/m2，每3周為一個周期）或長春瑞濱+順鉑（NP）方案（第1、8天予長春瑞濱25 mg/m2，第1～3天予以順鉑35 mg/m2，每3周為一個周期），小細胞肺癌采用依托泊苷+順鉑（EP）方案（第1、8天予順鉑35 mg/m2，第1～3天予以依托泊苷100 mg/m2，每3周為一個周期）。

1.3 檢測指標

應用BD FACSanto流式細胞儀及流式抗體（購自美國BD公司）檢測所有患者連續5個化療周期化療前及化療后1個月（以排除化療對免疫細胞的一過性殺傷作用）晨起空腹外周血T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、B 細胞、自然殺傷（natural killer，NK）細胞水平及程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）、細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA-4）、淋巴細胞活化基因 3（lymphocyte activating gene 3，LAG-3）表達水平。檢測具體操作步驟：5 ml全血加入抗凝劑抗凝，與10 μl相應抗體混勻，同型對照，室溫下避光孵育20 min，加入紅細胞裂解液，室溫下避光5～10 min，離心5 min后棄上清，洗滌2次加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）并上機檢測。采用流式細胞微球陣列術試劑盒（購自美國BD公司）檢測所有患者各周期化療后外周血白細胞介素（interleukin，IL）-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）水平，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，用梯度法稀釋各細胞因子的標準液，加入微球混合液和藻紅蛋白熒光染液，混勻后避光3 h，加入洗液后離心棄上清，上機檢測各標本細胞因子濃度。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 淋巴細胞亞群數量及 T細胞表面共抑制分子水平變化趨勢

124例患者在5個周期化療過程中，外周血CD4+T細胞明顯增加（F=12.347，P=0.000），CD8+T細胞、B細胞、NK細胞減少（F=5.425、4.237、3.021，P=0.000、0.002、0.012），PD-1水平明顯提高（F=5.123，P=0.002）；CTLA-4、LAG-3水平無明顯差異（F=1.247、0.648，P=0.279、0.574）。（表1）

2.2 細胞因子水平變化

124例肺癌患者5個周期化療過程中，各周期化療后外周血IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α及IFN-γ水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表 2）

2.3 淋巴細胞亞群數量及共抑制分子表達水平與肺癌臨床分期、分化程度的關系

Ⅲ～Ⅳ期、低分化的肺癌患者外周血CD4+/CD8+水平分別低于I～Ⅱ期、高中分化患者，差異均有統計學意義（t=2.698、2.567，P＜0.05）；不同臨床分期及分化程度的肺癌患者CD3+、CD4+、CD8+、LAG-3、CTLA-4、PD-1、B細胞、NK細胞水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表3）

表1 124例肺癌患者各周期化療中淋巴細胞亞群及 T細胞表面共抑制分子水平（±s）

表1 124例肺癌患者各周期化療中淋巴細胞亞群及 T細胞表面共抑制分子水平（±s）

指標CD4+CD8+B細胞NK細胞PD-1 CTLA-4 LAG-3 36.15±10.86 25.14±7.04 10.38±3.43 14.12±8.02 11.78±5.32 2.47±1.45 2.72±1.60 41.33±11.31 23.61±7.33 10.02±4.63 13.15±7.46 12.02±4.35 2.84±1.71 2.49±1.22 44.02±12.87 22.61±6.79 9.81±2.95 12.20±8.27 14.18±5.01 2.67±1.53 2.37±1.57 51.39±12.60 21.63±6.63 8.17±2.91 11.08±7.84 15.01±6.82 2.78±1.64 2.26±1.89 54.52±10.11 19.84±6.59 7.25±2.34 9.56±5.46 17.44±8.17 2.60±1.91 2.50±1.46化療第一周期化療第二周期化療第三周期化療第四周期化療第五周期

表2 124例肺癌患者各周期化療后外周血細胞因子水平（pg/ml，±s）

表2 124例肺癌患者各周期化療后外周血細胞因子水平（pg/ml，±s）

指標TNF-αIFN-γIL-2IL-4IL-6IL-10IL-17 2.83±0.80 6.91±2.64 2.10±0.41 3.10±1.12 10.78±5.32 3.87±1.45 22.02±15.60 2.76±0.92 6.87±2.71 2.12±0.53 3.15±1.06 11.02±4.65 3.64±1.55 21.38±16.62 2.79±0.75 6.86±2.57 2.13±0.45 3.20±1.26 10.11±6.10 3.90±1.63 23.27±14.57 2.81±0.83 6.90±2.63 2.08±0.36 3.08±1.37 11.21±6.12 3.78±1.64 22.26±13.89 2.77±0.93 6.89±2.31 2.23±0.64 3.19±1.64 10.56±5.89 3.90±1.81 22.50±15.46化療第一周期化療第二周期化療第三周期化療第四周期化療第五周期

3 討論

以鉑類為主的聯合化療是肺癌重要的治療方式之一，可以減輕患者臨床癥狀，改善生活質量，延長生存時間，但傳統化療在腫瘤治療中缺乏特異性，易出現各種化療相關不良反應，為實現腫瘤個體化治療，許多學者利用各種分子指標和免疫指標對腫瘤患者進行評估，指導臨床治療。腫瘤的發生、發展過程與機體免疫功能異常密切相關，近年來隨著腫瘤免疫研究的不斷深入，學者發現許多腫瘤患者體內免疫細胞數量異常及細胞表面抑制性受體表達異常，參與腫瘤的免疫逃逸等過程[8]。腫瘤免疫治療通過調整機體免疫功能，增強機體的抗腫瘤能力，在許多腫瘤治療中獲得較好的臨床療效[9]。

以往有研究表明，肺癌組患者與健康對照組相比，CD3+T細胞、CD4+T細胞比例及CD4+/CD8+明顯較低[10]，CD3分子與T細胞識別抗原形成復合物，通過結合抗原傳遞活化信號，是T細胞表面標記。CD4+T細胞是一種輔助性T細胞，協助機體抗腫瘤免疫反應。有研究表明，肺癌患者在多種免疫抑制因素作用下處于免疫抑制狀態，抑制CD3+、CD4+的分化成熟，進而減少 CD3+、CD4+數量[11]。本研究中分析了肺癌組患者化療前淋巴細胞亞群水平與臨床分期及分化程度的關系，結果表明Ⅲ～Ⅳ期、低分化的肺癌患者外周血CD4+/CD8+水平分別低于I～Ⅱ期、高中分化患者，與以往研究一致[12]，其機制可能與高分期、低分化腫瘤負荷大，腫瘤產生較多免疫抑制因子有關。在連續5個周期化療過程中，患者外周血CD4+T細胞明顯增加，CD8+T細胞、B細胞、NK細胞明顯減少，與國內研究報道一致[13]，其機制可能與腫瘤患者細胞免疫功能受到抑制，輔助識別和直接殺傷腫瘤細胞功能下降，機體處于對腫瘤的免疫耐受狀態有關[14]。此外，化療后腫瘤負荷降低，腫瘤產生的抑制免疫系統的物質減少。化療引起的淋巴細胞水平降低能夠刺激機體免疫系統，這種自穩性增生能夠增強機體抗腫瘤免疫應答[15]。腫瘤微環境中的各種細胞在各種刺激、因子作用下均可產生細胞因子，如IL-10、IL-6參與腫瘤細胞發生上皮-間充質轉化，促進腫瘤細胞的局部浸潤和遠處轉移，IL-2參與巨噬細胞極化為M2型，與腫瘤細胞的免疫耐受有關。本研究中對肺癌患者多周期化療過程中外周血細胞因子 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α及 IFN-γ進行檢測，差異均無統計學意義，可能與外周血細胞因子檢測特異度低有關，進一步檢測腫瘤局部微環境中腫瘤細胞因子表達情況，可能有助于解釋細胞之間相互作用的機制。

表3 不同臨床分期及分化程度肺癌患者淋巴細胞亞群數量及共抑制分子表達水平（±s）

表3 不同臨床分期及分化程度肺癌患者淋巴細胞亞群數量及共抑制分子表達水平（±s）

指標臨床分期I～Ⅱ（n=39）Ⅲ～Ⅳ（n=85）分化程度高中分化（n=53）低分化（n=71）CD3+CD4+CD8+CD4+/CD8+LAG-3 CTLA-4 PD-1 B細胞NK細胞69.7±11.1 36.4±11.5 25.2±7.8 1.6±0.7 2.6±1.5 2.8±1.9 13.2±3.4 12.2±2.7 17.8±3.9 65.0±9.8 37.5±10.1 28.7±5.8 1.3±0.6 2.4±2.1 2.6±2.0 11.9±5.2 10.2±2.1 15.8±4.7 66.2±12.8 37.1±9.1 26.7±8.8 1.5±0.5 2.5±2.0 2.6±1.9 13.9±6.4 11.1±3.9 16.7±4.0 64.9±12.3 35.9±10.4 24.9±5.8 1.3±0.7 2.4±2.2 2.5±1.9 11.9±6.8 11.8±3.0 15.2±3.9

本研究患者在5個周期化療過程中，PD-1水平明顯增加。PD-1位于活化T細胞表面，與腫瘤細胞表面相應配體程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）結合，激活PD-1/PD-L1信號通路，誘導腫瘤特異性T細胞凋亡，腫瘤局部形成免疫抑制性的微環境。以往研究亦證實，腫瘤微環境中的LAG-3、CTLA-4及PD-1等細胞表面共抑制分子表達水平增加，可導致殺傷腫瘤細胞功能下降，表現為穿孔素及顆粒酶分泌能力降低，T細胞免疫監視功能下降，介導腫瘤免疫逃逸[16]。化療后T細胞表面PD-1表達上調可能與腫瘤細胞誘導T細胞表面PD-1表達，進而抑制T細胞的增殖活化有關。有研究表明，PD-1高表達時存在T細胞耗竭，T細胞功能受抑制，與患者較短的生存時間和不良預后密切相關[17]。

綜上所述，研究肺癌多周期化療中外周血淋巴細胞亞群數量變化及T細胞表面共抑制分子變化，對于了解機體免疫狀態的變化，選擇敏感患者予以免疫治療具有重要意義，有待進一步研究。