腫瘤微環(huán)境相關(guān)因子與直腸癌新輔助化療效果及微衛(wèi)星穩(wěn)定狀況的關(guān)系

羅長順，劉坤，汪黎明

1四川省第二中醫(yī)醫(yī)院普外科，成都610031

2四川大學(xué)華西醫(yī)院西藏成辦分院腫瘤科，成都6100000

直腸癌是臨床常見的惡性腫瘤，外科手術(shù)為其主要治療手段，但由于直腸癌的解剖學(xué)特征較為特殊，因此，直腸癌患者的病死率和復(fù)發(fā)率均較高[1-2]。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）是構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的主要成分，影響著腫瘤的發(fā)展與結(jié)局。CD8+、CD4+T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的識別與清除作用，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）對患者自體同源腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答具有抑制作用，也是免疫治療失敗的主要原因。程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）、細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4）與Treg協(xié)同作用可導(dǎo)致免疫逃逸[3-4]。因此，本研究對新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NAC）前后直腸癌患者腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫標(biāo)志物的表達(dá)情況及PD-L1于直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）狀態(tài)與微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stability，MSS）狀態(tài)下的表達(dá)差異性進(jìn)行分析，旨在為直腸癌的臨床診療提供借鑒，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年5月至2018年6月于四川省第二中醫(yī)醫(yī)院接受治療的直腸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者于NAC后行手術(shù)；②治療前經(jīng)腸鏡活檢確診為直腸腺癌；③臨床資料完整；④確診前未接受過內(nèi)分泌治療、放療、化療等相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①進(jìn)行過腹部手術(shù)或其他重大手術(shù)；②術(shù)前接受過放療、化療；③手術(shù)過程中存在腫瘤廣泛轉(zhuǎn)移或腹腔廣泛粘連。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入90例直腸癌患者，年齡為33～79歲，平均年齡為（55.18±8.72）歲；男51例，女39例；浸潤深度（根據(jù)T分期）：T3期28例，T4期62例；分化程度：低分化19例，中分化66例，高分化5例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移67例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例；腫瘤距離肛緣1～13 cm，平均（5.06±1.84）cm。90例直腸癌患者接受了放療聯(lián)合化療的方案，放療劑量為25～50 Gy，并于同期接受了2～4個周期的奧沙利鉑+亞葉酸鈣+5-氟尿嘧啶（FOLFOX4）方案化療。

1.2 主要試劑與儀器

試劑：PD-L1（克隆號 sp142）、CD4（克隆號EP204）、CD8（克隆號C8/114B）均購自上海基因科技公司，F(xiàn)OXP3（克隆號236A/E7）購自美國Abcam公司，CTLA-4（克隆號sc-376016）購自美國Santa Cruz公司。儀器：HI1220型烤片機(jī)和RM2235型切片機(jī)均購自德國Leica公司，PCL-05型免疫組化防脫載玻片購自日本松浪硝子工業(yè)株式會社，3500Dx型基因分析儀購自美國ABI公司，加熱振蕩混合儀購自北京鼎昊源科技有限公司。

1.3 組織芯片制備

①采用組織芯片空白陣列蠟塊制備儀制作受體蠟塊，孔徑為1.8 mm，組織陣列為9×16，大小為2.5 cm×4.0 cm；②重新對蠟塊進(jìn)行切片，病理閱片，標(biāo)記腫瘤細(xì)胞較多的位置，對受體蠟塊對應(yīng)位置行空芯穿刺針穿孔，取出組織芯；③繪制組織芯片陣列圖，兩個孔上樣于第一行內(nèi)，應(yīng)用組織芯片、陣列圖進(jìn)行定位標(biāo)記，依據(jù)陣列圖將組織芯片填入組織，預(yù)防穿刺偏差、掉片或脫片等；④融合，預(yù)防孔內(nèi)組織芯下滑，載玻片內(nèi)組織芯片倒放，烤箱內(nèi)放置10 min，室溫冷卻，反復(fù)多次以便受體蠟塊和組織芯片融合。

1.4 免疫組織化學(xué)染色方法及判定標(biāo)準(zhǔn)

采用免疫組織化學(xué)染色法檢測患者治療前的活檢組織標(biāo)本與治療后的手術(shù)切除組織標(biāo)本，取經(jīng)石蠟包埋的切片進(jìn)行脫蠟處理，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，熱修復(fù)暴露抗原位點(diǎn)，置入孵育盒內(nèi)，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次，每次3 min，加入山羊血清，孵育10 min，再加入一抗兔多克隆抗體，4℃下孵育過夜。PBS沖洗3次，每次5分鐘，滴入二抗，室溫下孵育10 min，使用PBS沖洗3次，每次3分鐘，再滴入辣根酶標(biāo)記的鏈酶卵白素，采用二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，中性樹膠封片。CD4主要表達(dá)于間質(zhì)TIL包膜內(nèi)，CD8主要表達(dá)于間質(zhì)TIL的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，PD-L1表達(dá)于間質(zhì)TIL的細(xì)胞核內(nèi)，同時腫瘤細(xì)胞也染色；叉頭框蛋白P3（forkhead box P3，F(xiàn)OXP3）、CTLA-4均表達(dá)于TIL的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，同時腫瘤細(xì)胞染色。每張切片均選取5個高倍視野，每視野選取100個細(xì)胞計數(shù)，無色為0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評分：＜30%為1分，≥30%為2分；兩項(xiàng)得分相乘，0～1分為陰性，2～6分則為陽性。使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件檢測圖像光密度。

1.5 病理評估

由兩位中級及以上職稱的醫(yī)師采用雙盲法閱片，選取5個高倍鏡視野，計算TIL的陽性細(xì)胞比例，并計算其平均值。NAC前后腫瘤病理反應(yīng)的評估依據(jù)Dworak等[5]的腫瘤退縮分級（tumor regression grade，TRG），共分為TRG 0～4五個等級，TRG0代表腫瘤無消退，腫瘤內(nèi)纖維化占比低于25%；TRG1代表腫瘤輕度消退，腫瘤內(nèi)纖維化占比為25%～50%；TRG2代表腫瘤中度消退，腫瘤內(nèi)纖維化程度高于50%；TRG3代表腫瘤重度消退，僅看到纖維組織，未看到腫瘤組織；TRG4代表腫瘤完全消退。將標(biāo)本進(jìn)行分級，TRG3和TRG4患者歸為應(yīng)答組（28例），TRG0～TRG2患者歸為無應(yīng)答組（62例）。

1.6 熒光多重聚合酶鏈反應(yīng)檢測MSI狀況

檢測2個五核苷酸重復(fù)標(biāo)記物（Penta E與Penta D）和5個單核核苷酸重復(fù)標(biāo)記物（MONO-27、NR-24、BAT-26、CAT-25、BAT-25），蠟塊重新制作切片，取8 mm切片2張以便DNA的提取，置于乙醇內(nèi)5 min，沖洗后晾干，使用刀片刮下組織至EP管內(nèi)，后行NDA提取，聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，最后行毛細(xì)管電泳分離，上機(jī)檢測，分析數(shù)據(jù)。采用熒光多重聚合酶鏈反應(yīng)檢測MSI狀況，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：Penta E與Penta D具有較高的多態(tài)性和較低的MSI，用于判別正常組織和腫瘤組織是否來源于同一患者。其中，高于2個Markers片段的大小發(fā)生改變?yōu)槲⑿l(wèi)星高度不穩(wěn)定（microsatellite instablehigh，MSI-H），判定是MS（I判別出現(xiàn)變化標(biāo)準(zhǔn)為≥3 bp）；1個Markers片段的大小出現(xiàn)變化為微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定（microsatellite instable-low，MSI-L），無Markers片段的大小發(fā)生改變?yōu)镸SS。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用配對t檢驗(yàn)和兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 直腸癌患者NAC前后免疫標(biāo)志物表達(dá)情況的比較

NAC后，直腸癌患者CD4+TIL、CD8+TIL、CTLA-4+TIL的表達(dá)水平均明顯高于NAC前，PD-L1+TIL的表達(dá)水平明顯低于NAC前，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。NAC前后，患者的FOXP3+TIL的表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 直腸癌患者NAC前后免疫標(biāo)志物表達(dá)水平的比較（%，x±s）

2.2 直腸癌患者臨床特征與病理反應(yīng)的關(guān)系

應(yīng)答組患者28例，無應(yīng)答組患者62例。兩組患者的年齡比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.375，P＜0.05）；兩組患者的組織分化程度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.620，P＜0.05）。兩組患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、性別、距離肛緣距離、浸潤深度比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

2.3 免疫標(biāo)志物表達(dá)情況與腫瘤病理反應(yīng)的關(guān)系

NAC前，應(yīng)答組患者CD4+TIL、PD-L1+TIL的表達(dá)水平均高于無應(yīng)答組，F(xiàn)OXP3+TIL的表達(dá)水平低于無應(yīng)答組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.068、22.647、20.021，P＜0.01）。應(yīng)答組患者NAC前后CD4+TIL、PD-L1+TIL、CTLA-4+TIL的表達(dá)差值分別為（3.20±0.45）%、（2.81±0.30）%、（1.06±0.64）%，均低于無應(yīng)答組的（3.89±0.41）%、（3.70±0.34）%、（3.89±0.68）%，而 CD8+TIL、FOXP3+TIL的表達(dá)差值分別（4.41±0.32）%、（5.32±0.51）%，均高于無應(yīng)答組的（0.65±0.31）%、（2.58±0.53）%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.170、11.908、18.607、52.742、22.968，P＜0.05）。（表3）

表2 不同組別直腸癌患者的臨床特征

表3 不同組別直腸癌患者NAC前后相關(guān)腫瘤免疫標(biāo)志物的表達(dá)水平（%，±s）

表3 不同組別直腸癌患者NAC前后相關(guān)腫瘤免疫標(biāo)志物的表達(dá)水平（%，±s）

免疫標(biāo)志物CD4+TIL PD-L1+TIL CD8+TIL FOXP3+TIL CTLA-4+TIL時間治療前治療后治療前治療后治療前治療后治療前治療后治療前治療后應(yīng)答組（n=28）19.70±5.28 22.90±5.71 13.24±1.05 10.43±1.07 19.98±6.73 24.39±6.37 9.17±2.09 14.49±4.07 7.22±3.19 6.16±3.15無應(yīng)答組（n=62）14.79±5.31 18.68±5.22 7.50±1.14 3.80±1.19 18.96±6.21 19.61±6.50 19.73±2.41 22.31±4.18 6.89±3.20 9.78±3.61

2.4 PD-L 1與MIS的關(guān)系

90例直腸癌患者中，MSI患者40例，MSS患者50例。MSI患者中PD-L1+TIL的陽性細(xì)胞比例為（10.49±1.06）%，高于MSS患者PD-L1+TIL的陽性細(xì)胞比例（3.09±1.08）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=32.566，P＜0.01）。

3 討論

CD4+T細(xì)胞不但可通過γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）殺傷腫瘤細(xì)胞，還可通過不同路徑將CD8+T細(xì)胞激活，被激活的CD8+T細(xì)胞可在腫瘤部位積聚，使細(xì)胞凋亡[6-7]。本研究結(jié)果顯示，NAC后，直腸癌患者CD8+TIL與CD4+TIL的表達(dá)水平均高于NAC前，說明NAC前患者機(jī)體內(nèi)的免疫能力普遍較低，而放化療可能會升高CD8+TIL和CD4+TIL的表達(dá)水平。但是，NAC前，CD8+TIL的表達(dá)水平對于患者的療效無明顯影響，說明與之前的局部免疫應(yīng)答狀況相比，行NAC時放化療對患者腫瘤免疫微環(huán)境的影響更重要[8-10]。

T細(xì)胞可激活負(fù)性信號，并通過與B7相互影響從而抑制T細(xì)胞活化，進(jìn)而刺激CTLA-4的陽性表達(dá)。同時，相關(guān)研究表明CTLA-4與患者的不良預(yù)后有一定關(guān)系[11]。本研究結(jié)果顯示，NAC后，患者CTLA-4+TIL的表達(dá)水平較治療前升高，說明放化療殺傷腫瘤細(xì)胞可使腫瘤細(xì)胞分泌抑制因子，使共刺激分子CD80/CD86或樹突狀細(xì)胞表層主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）分子的表達(dá)水平發(fā)生變化，CTLA-4亦出現(xiàn)變化。Treg對機(jī)體自體同源腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答有抑制作用，通常被認(rèn)為是導(dǎo)致免疫治療失敗的主要因素。目前，F(xiàn)OXP3被認(rèn)為是Treg具有特異性的標(biāo)記物[12-14]。本研究結(jié)果顯示，NAC前后，患者FOXP3+TIL的表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但NAC前后FOXP3+TIL低表達(dá)者易達(dá)到應(yīng)答狀態(tài)。在臨床中，放化療選擇性的消耗會提高部分患者抗腫瘤免疫的發(fā)生率，利于腫瘤消退，但NAC所引發(fā)的腫瘤周邊Treg不良反應(yīng)亦會增多。

PD-L1是存在于T淋巴細(xì)胞表層的一種抑制分子，由樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞等表達(dá)，其表達(dá)量于激活抗原呈遞細(xì)胞后升高。在正常機(jī)體中，PD-1/PD-L1信號通路對維持機(jī)體的免疫耐受具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在多種腫瘤中的表達(dá)上調(diào)，在腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[15-17]。但是，本研究中，NAC后，PD-L1+TIL的表達(dá)水平明顯低于NAC前（P＜0.01），說明NAC可降低PD-L1在腫瘤中的表達(dá)水平，進(jìn)而通過腫瘤免疫應(yīng)答提高治療效果。PD-1/PD-L1信號通路可通過多方面對T細(xì)胞起到負(fù)性調(diào)節(jié)的作用，但PD-1不是PD-L1所介導(dǎo)的唯一受體，PD-L1還可導(dǎo)致PD-1陰性T淋巴細(xì)胞凋亡，說明T淋巴細(xì)胞內(nèi)可能存在導(dǎo)致PD-L1免疫抑制的相關(guān)受體。本研究結(jié)果顯示，MSI直腸癌患者PD-L1+TIL內(nèi)的陽性細(xì)胞比例高于MSS直腸癌患者，說明直腸癌MSI狀態(tài)可能導(dǎo)致PD-L1+TIL內(nèi)的陽性細(xì)胞高表達(dá)，進(jìn)而影響直腸癌患者的臨床療效。

綜上所述，MSI直腸癌患者腫瘤微環(huán)境內(nèi)PDL1+TIL的陽性率較高，PD-L1阻斷劑可能對MSI直腸癌患者的療效更好。但是，PD-L1+TIL表達(dá)與直腸癌患者臨床療效的關(guān)系仍需今后更進(jìn)一步深入探究。