微小RNA-149- 5 p在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)情況及作用機(jī)制

王戰(zhàn)芳，張芳芳，韓陽利，王敏芳

平頂山市第一人民醫(yī)院血液科，河南 平頂山4670000

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是一種常見的淋巴系統(tǒng)腫瘤，屬于非霍奇金淋巴瘤[1]。DLBCL的名字來源于其生長方式，呈彌漫生長模式[2]。DLBCL包括活化B細(xì)胞樣和生發(fā)中心B細(xì)胞樣兩種[3]。miRNA-149-5p是一種微小RNA（microRNA，miRNA），長度為18～25個核苷酸，占人類總基因的1%左右[4]。miRNA可以通過影響人體內(nèi)信號通路調(diào)節(jié)惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[5]。有研究表明，miRNA-149-5p與腫瘤、心血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病均有密切關(guān)系[6]。但目前關(guān)于miRNA-149-5p調(diào)控DLBCL發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制尚不明確。本研究分析DLBCL中miRNA-149-5p、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）/p65信號通路和相關(guān)凋亡因子B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、胱天蛋白酶 3（caspase 3）及Ki-67蛋白的表達(dá)情況，探討其與DLBCL的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2011年1月1日至2017年1月1日于平頂山市第一人民醫(yī)院就診的DLBCL患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《中國彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤診斷與治療指南》[7]中DLBCL的診斷標(biāo)準(zhǔn)；經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為DLBCL。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他腫瘤；合并嚴(yán)重的心肺疾病。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入150例DLBCL患者，作為觀察組。另選取同期70例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生患者，作為對照組。DLBCL組中，男78例，女72例；年齡12～75歲，平均（45.21±3.02）歲；75例患者檢查了血清乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH），LDH水平正常（≤245 U/L）40例，LDH水平升高（＞245 U/L）35例；109例患者檢查了血清β2微球蛋白（β2 microglobulin，β2-MG），β2-MG水平正常（1～3 mg/L）41例，β2-MG水平升高（＞3 mg/L）68例；淋巴瘤國際預(yù)后指數(shù)（international prognostic index，IPI）評分：0～2分71例，3～5分79例。對照組中，男35例，女35例；年齡14～74歲，平均（46.39±4.97）歲。兩組患者的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑與儀器

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、無水乙醇、異丙醇均購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒、miRNA-149-5p上下游引物均購自美國Gene Copoeia公司；Bcl-2抗體、caspase 3抗體、Ki-67抗體、NF-κB/p65抗體均購自美國Abcam公司；低溫離心機(jī)購自無錫市龍?zhí)┗C(jī)械設(shè)備有限公司；實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀、電泳儀均購自美國Bio-Rad公司；石蠟切片機(jī)購自德國LEICA公司。

1.3 RT-PCR檢測miRNA-149- 5 p的相對表達(dá)量

采用胰蛋白酶預(yù)處理樣本，應(yīng)用Trizol提取細(xì)胞總RNA，采用分光光度計測定RNA的純度和濃度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行RTPCR，反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 8 s，58 ℃ 35 s，72℃40 s，共40個循環(huán)，以GADPH基因為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計算 miRNA-149-5p 的相對表達(dá)量。miRNA-149-5p上游引物：5'-GTGAGGTTCTTGGGAGCCAA-3'，下 游 引 物 5'-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3'。GADPH上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下 游 引 物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。依據(jù)miRNA-149-5p相對表達(dá)量的不同，將DLBCL患者分為miRNA-149-5p高表達(dá)組（miRNA-149-5p相對表達(dá)量＞1.5）和miRNA-149-5p低表達(dá)組（miRNA-149-5p相對表達(dá)量≤1.5）。

1.4 免疫組織化學(xué)染色方法及結(jié)果判定

采用3%的H2O2浸泡組織切片10 min，采用0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液高壓修復(fù)2 min。加入一抗4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育30 min。二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復(fù)染10 s，梯度乙醇脫水后常規(guī)透明，封片，在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取10個視野觀察。依據(jù)NF-κB/p65、caspase 3、Bcl-2陽性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行評分。陽性細(xì)胞比例評分：0%～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；依據(jù)染色強(qiáng)度評分：無色為0分，輕度染色為1分，中度染色為2分，深度染色為3分。陽性細(xì)胞比例評分與染色強(qiáng)度評分相乘，≤2分為陰性，＞3分為陽性[8]。Ki-67陽性細(xì)胞百分比≤40%為陰性，＞40%為陽性[9]。

1.5 隨訪

采用電話、門診方式對患者進(jìn)行隨訪，隨訪截止時間為2020年1月30日。比較miRNA-149-5p高表達(dá)組和低表達(dá)組患者的3年生存情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-149- 5 p相對表達(dá)量的比較

觀察組患者的miRNA-149-5p相對表達(dá)量為（1.32±0.14），明顯低于對照組的（4.36±1.02），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=24.797，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征DLBCL患者中miRNA-149- 5 p表達(dá)情況的比較

miRNA-149-5p表達(dá)情況可能與DLBCL患者的年齡、性別、臨床分期、LDH水平、β2-MG水平無關(guān)（P＞0.05），可能與Hans分型有關(guān)（P＜0.01）。（表1）

2.3 NF- κB/p65、Bcl- 2、caspase 3、Ki-67蛋白表達(dá)情況的比較

觀察組中NF-κB/p65、Bcl-2、Ki-67蛋白陽性率均明顯高于對照組，caspase 3蛋白陽性率明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表2）

表1 不同臨床特征DLBCL患者中miRNA-149- 5 p表達(dá)情況的比較（n=150）

表2 兩組患者中NF- κB/p65、Bcl- 2、caspase 3、Ki-67蛋白陽性情況的比較[n（%）]

2.4 生存情況的比較

miRNA-149-5p高表達(dá)組患者的3年生存率為46.4%（51/110），明顯高于miRNA-149-5p低表達(dá)組的17.5%（7/40），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=10.304，P＜0.01）。

3 討論

NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，其活化后與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系[10]。本研究結(jié)果顯示，DLBCL患者中miRNA-149-5p的表達(dá)水平明顯降低，NF-κB的表達(dá)水平升高，說明miRNA-149-5p低表達(dá)和NF-κB高表達(dá)可能促進(jìn)DLBCL的發(fā)生和發(fā)展。

miRNA-149-5p過表達(dá)會促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，胱天蛋白酶（caspase）家族就是其中之一，caspase 3、caspase 9是caspase家族中重要的凋亡蛋白[11]。caspase 9基因處于caspase家族激活基因的最前端，可以剪切caspase底物引起級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。miRNA-149-5p過表達(dá)還可促進(jìn)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，Bcl-2家族中主要有Bcl-2蛋白和Bax蛋白，這兩種蛋白分別具有抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能[13-15]。郝紫騰等[16]研究表明，caspase家族是細(xì)胞凋亡的主要因素之一。miRNA-149-5p可以激活caspase家族的凋亡啟動子caspase 9，使凋亡因子啟動并促進(jìn)級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，DLBCL患者中caspase 3表達(dá)水平降低，可能是由于miRNA-149-5p呈低表達(dá)，無法激活凋亡啟動子caspase 9。本研究結(jié)果表明，DLBCL患者中Bcl-2表達(dá)水平升高，抑制了DLBCL細(xì)胞的凋亡，與周倩萍[17]的研究結(jié)果一致。譚亞和周賢[18]的研究表明，miRNA可作用于抑癌基因和促癌基因，且與DLBCL的關(guān)系密切。除了促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖也是重要的方法之一，腫瘤細(xì)胞的增殖受到相關(guān)基因（如Ki-67）表達(dá)水平的影響。Ki-67是增殖細(xì)胞核抗原，其分子量為345 kD，與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。當(dāng)Ki-67高表達(dá)時，細(xì)胞的有絲分裂加速，細(xì)胞增殖加速；當(dāng)Ki-67低表達(dá)時，細(xì)胞的增殖速率降低[19]。本研究結(jié)果顯示，觀察組中Ki-67蛋白陽性率明顯高于對照組，說明DLBCL患者中miRNA-149-5p低表達(dá)可能促進(jìn)了Ki-67蛋白的表達(dá)，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤的惡性發(fā)展。此外，本研究還表明，miRNA-149-5p表達(dá)情況可能與DLBCL患者的年齡、性別、臨床分期、LDH水平、β2-MG水平無關(guān)（P＞0.05），可能與Hans分型有關(guān)（P＜0.01）。

綜上所述，DLBCL患者中miRNA-149-5p表達(dá)下調(diào)，可能通過凋亡途徑影響腫瘤的發(fā)生，miRNA-149-5p低表達(dá)可能與DLBCL患者預(yù)后不良有關(guān)。但調(diào)控DLBCL的信號通路較多，在后續(xù)的實(shí)驗中可探討其他信號通路對DLBCL影響的機(jī)制。