槲皮素對宮頸癌HeLa細胞凋亡、遷移的影響

唐陽芳,陳 蕊,張少華

(西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦科,西安 710077;*通訊作者,E-mail:68626817@qq.com)

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率僅次于乳腺癌、直腸癌。全世界每年約有50萬初發(fā)宮頸癌患者,中國每年新發(fā)病例約13萬,成為女性患者主要死因之一[1,2]。宮頸癌治療以手術及放化療為主,但由于化療藥物的神經(jīng)毒性、關節(jié)肌肉疼痛、脫發(fā)等毒副反應及耐藥等問題,使其臨床應用受到了一定限制[3,4],急需尋找新的治療手段。近年來,在各種抗腫瘤藥物中,天然植物抗腫瘤藥物因其低毒性、高利用度等特點已受到了醫(yī)藥學界的高度重視[5]。槲皮素是廣泛存在于多種植物中的多醇羥基黃酮類化合物,研究證實其具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗病毒、心血管保護、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理學活性[6]。目前研究表明,槲皮素具有抗宮頸癌作用,可抑制宮頸癌細胞增殖、促進宮頸癌細胞凋亡、抑制宮頸癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移等[7,8],但作用機制尚不完全明確。氧化應激與宮頸癌等惡行腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[9],也被作為宮頸癌的治療靶點[10]。本研究以宮頸癌HeLa細胞為對象,觀察槲皮素對HeLa細胞凋亡及遷移的影響,探討氧化應激在其中的作用,為初步探索槲皮素在宮頸癌中的作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

槲皮素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司),用DMSO超聲裂解槲皮素溶解,配成不同質(zhì)量濃度的溶液,用0.22 μm微孔濾器過濾,滅菌,4 ℃保存?zhèn)溆谩?0%胎牛血清、0.25%胰酶、DMEM(美國Gibco公司),細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司),Transwell遷移小室(美國BD公司),細胞活性氧(ROS)檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司),丙二醛(MDA)測試試劑盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

常規(guī)復蘇HeLa細胞,將細胞移到含有5 ml DMEM培養(yǎng)基的離心管中,室溫1 200 r/min離心3 min,棄上清。用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)懸浮細胞,接種到培養(yǎng)皿中,輕輕吹打混勻,37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。每2-3 d傳代換液1次,取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。將處于對數(shù)生長期的細胞,用0.25%胰酶消化、收集細胞,用DMEM培養(yǎng)基制成單細胞懸液,按照每孔5×105個將細胞均勻的接種到6孔板中,37 ℃、5% CO2飽和濕度條件培養(yǎng)過夜。加不同濃度槲皮素(0,20,40,80 μmol/L)處理48 h,不加槲皮素組(0 μmol/L)設為對照組。

1.3 流式細胞術檢測細胞凋亡

用不含EDTA的0.25%胰酶消化細胞,終止消化后收集細胞,1 500 r/min離心5 min,棄上清,加PBS重懸。用PBS將細胞潤洗2次,1 500 r/min離心5 min。按照Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒操作說明進行:加入500 μl Binding Buffer,重懸細胞;5 μl Annexin Ⅴ-FITC混勻后加入5 μl PI,混勻;室溫避光反應15 min(同時設陰性對照,即正常細胞不加Annexin和PI);流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.4 Transwell法檢測細胞遷移

取上述處理48 h的細胞,0.25%胰酶消化、收集細胞,室溫1 200 r/min離心3 min,去上清,PBS潤洗2次,清洗掉殘余血清。無血清培養(yǎng)基重懸細胞,細胞計數(shù)板計數(shù),用無血清培養(yǎng)基稀釋細胞濃度至2×105/ml,備用。在24孔板中加入800 μl 10%FBS培養(yǎng)基(含雙抗),并放入Transwell小室,在Transwell上室分別接入200 μl各組細胞懸液,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)48 h。取出Transwell,PBS小心清洗小室1次,70%冰乙醇溶液固定細胞1 h。0.5%結(jié)晶紫染液染色,室溫放置20 min,PBS清洗后用干凈棉球?qū)⑸鲜乙粋?cè)未遷移的細胞擦凈,然后顯微鏡觀察拍照,計數(shù)遷移細胞數(shù)。

1.5 DCFH-DA檢測細胞內(nèi)ROS水平

用不含EDTA的0.25%胰酶消化、收集細胞,1 500 r/min離心5 min,去上清,加PBS重懸。用PBS將細胞潤洗2次,1 500 r/min離心5 min。按照DCFH-DA細胞ROS檢測試劑盒操作說明進行:向細胞沉淀中加入稀釋好的DCFH 1 ml;37 ℃培養(yǎng)箱孵育20 min,每隔3 min混勻1次;用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3次;流式細胞儀檢測細胞DCFH-DA熒光強度。

1.6 MDA含量檢測

樣品前處理:HeLa細胞置于EP管中,加入一定量的低滲溶液或雙蒸水,直接放入液氮3-5 s,立即提出轉(zhuǎn)入-20 ℃冰箱(20-30 s),再取出室溫解凍,解凍后按上述步驟重復3次,即對細胞進行反復凍融。將勻漿液于5 000 r/min離心5 min,取上清待用。按照MDA測試試劑盒操作說明進行,漩渦混勻器混勻,試管口用保鮮膜扎緊,用針頭刺一個小孔,95 ℃水浴40 min,取出后流水冷卻,然后3 500 r/min離心10 min。取上清測532 nm處吸光值OD,計算細胞MDA含量。MDA含量(nmol/mg)=(測定OD值-對照OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度(10 nmol/L)/待測樣本蛋白濃度(mg/ml)。

1.7 總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力檢測

樣品前處理同1.6,按照T-SOD測試盒進行操作,混勻,室溫放置10 min,于波長550 nm處測定吸光度值OD。總SOD活力(U/mg)=(對照OD-測定OD)/對照OD/0.5×(反應液總體積/取樣量)/蛋白濃度。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對HeLa細胞凋亡的影響

在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn),與0 μmol/L相比,槲皮素處理細胞48 h,不同濃度組HeLa細胞生長受到明顯抑制(見圖1)。進一步采用流式檢測細胞凋亡,結(jié)果顯示與0 μmol/L相比,各濃度槲皮素組的細胞凋亡率明顯上升,且凋亡率隨著槲皮素濃度的升高而增加。0,20,40,80 μmol/L槲皮素組凋亡率分別為 (4.61±0.76)%,(9.47±0.54)%,(14.78±0.93)%,(23.34±1.96)%,各組之間比較,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05,見圖2)。

圖1 不同濃度槲皮素處理的HeLa細胞形態(tài)觀察Figure 1 Morphology of HeLa cells in different treatment groups

圖2 槲皮素對HeLa細胞凋亡的影響 (n=3)Figure 2 Effect of quercetin on apoptosis of HeLa cells (n=3)

2.2 槲皮素對HeLa細胞遷移的影響

Transwell細胞遷移實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),與0 μmol/L相比,不同濃度槲皮素處理細胞48 h,HeLa細胞遷移受到明顯抑制,且遷移數(shù)隨著槲皮素濃度的升高而減少。0,20,40,80 μmol/L槲皮素組的細胞遷移數(shù)分別為(104.67±5.03)個,(94.00±3.46)個,(75.00±9.54)個,(55.67±4.62)個。各組之間比較,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05,見圖3)。

圖3 槲皮素對HeLa細胞遷移的影響 (n=3)Figure 3 Effect of quercetin on migration of HeLa cells (n=3)

2.3 槲皮素對細胞表達ROS的影響

流式檢測ROS的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),與0 μmol/L相比,不同濃度槲皮素處理細胞48 h,HeLa細胞中ROS表達增加,且隨著槲皮素濃度的升高而增加。0,20,40,80 μmol/L槲皮素組的ROS表達量(DCFH-DA熒光強度)分別為65 402.00±886.87,76 497.00±9 648.64,95 774.66±3 440.82,106 135.00±3 724.35。各組之間比較,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05,見圖4)。

圖4 槲皮素對HeLa細胞ROS表達的影響 (n=3)Figure 4 Effect of quercetin on the expression of ROS in HeLa cells (n=3)

2.4 槲皮素對細胞表達MDA的影響

試劑盒檢測細胞MDA含量的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),與0 μmol/L相比,不同濃度槲皮素處理細胞48 h,HeLa細胞中MDA表達增加,且隨著槲皮素濃度的升高而增加。0,20,40,80 μmol/L槲皮素組MDA含量分別為(1.85±0.06)nmol/mg,(2.52±0.22)nmol/mg,(3.50±0.24)nmol/mg,(4.19±0.43)nmol/mg。各組之間比較,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05,見圖5)。

與0 μmol/L相比,* P <0.05;與20 μmol/L相比,#P <0.05;與40 μmol/L相比,&P <0.05圖5 槲皮素對HeLa細胞MDA含量的影響 (n=3)Figure 5 Effect of quercetin on the content of MDA in HeLa cells (n=3)

2.5 槲皮素對細胞SOD活力的影響

試劑盒檢測細胞總SOD活力的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),與0 μmol/L相比,不同濃度槲皮素處理細胞48 h,HeLa細胞中SOD活力下降,且隨著槲皮素濃度的升高而下降。0,20,40,80 μmol/L槲皮素組的總SOD活力分別為(75.28±0.39)U/mg,(62.84±3.76)U/mg,(52.61±1.51)U/mg,(35.52±3.72)U/mg。各組之間比較,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05,見圖6)。

與0 μmol/L相比,* P <0.05;與20 μmol/L相比,#P <0.05;與40 μmol/L相比,&P <0.05圖6 槲皮素對HeLa細胞SOD活力的影響 (n=3)Figure 6 Effect of quercetin on the activity of total SOD in HeLa cells (n=3)

3 討論

宮頸癌是常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)病率及死亡率較高,且年輕化趨勢明顯,嚴重危害廣大婦女的健康和生命[1,11]。目前宮頸癌的治療手段以手術為主、放化療為輔,但治療效果不理想,副作用較多,預后率低,費用較高,因此尋找放化療中毒副作用小且療效確切的輔助藥物成為研究熱點[12]。據(jù)報道,槲皮素在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抗癌活性,如乳腺癌、肝癌、肺癌、白血病等[6-8]。國內(nèi)外研究也認為槲皮素具有治療宮頸癌的生物學活性[7]。癌細胞具有無限增殖的特點,大量研究結(jié)果提示,槲皮素可不同程度地抑制宮頸癌HeLa細胞增殖,且呈時間和濃度依賴性[13,14]。細胞凋亡是細胞的程序性死亡,維持細胞的健康生存和死亡平衡。凋亡信號有助于保護基因組的完整性,而凋亡缺陷可能促進腫瘤的發(fā)生。腫瘤細胞可能通過多種分子機制抑制細胞凋亡并獲得對凋亡因子的抗性[15]。細胞凋亡是腫瘤治療中的關注要點,很多抗癌藥物是通過誘導各自敏感的細胞發(fā)生凋亡來實現(xiàn)的[16]。有研究表明,槲皮素可以誘導HeLa細胞凋亡[17-19],本研究應用流式細胞儀檢測不同濃度的槲皮素作用于HeLa細胞后細胞凋亡率的變化,也提示細胞凋亡率隨著藥物濃度的升高而增加。此外,腫瘤細胞的侵襲力與癌癥發(fā)展轉(zhuǎn)移密切相關,本研究還利用穿透小室Transwell法檢測了HeLa細胞遷移能力,結(jié)果提示槲皮素可以抑制細胞的遷移能力,且呈濃度依賴性,與既往報道采用其他研究方法得出的結(jié)果相符[19,20]。結(jié)合本研究結(jié)果,認為槲皮素的抗癌活性主要與其抑制癌細胞增殖與轉(zhuǎn)移,誘導細胞凋亡密切相關[6,8]。此外,據(jù)報道槲皮素與化療藥物聯(lián)用能起到化療增敏作用,并有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多重耐藥性[21],這可能是槲皮素發(fā)揮抗癌作用的另一機制。

機體在遭受外界各種有害刺激的時候,會發(fā)生應激反應而產(chǎn)生大量的高活性分子,如ROS,以應對外界對組織和細胞造成的損傷。當機體產(chǎn)生的ROS自由基過多,超出機體的清除能力,進而引起氧化與抗氧化之間失衡的病態(tài)生理現(xiàn)象被稱為氧化應激。機體存在兩類抗氧化系統(tǒng),其中一類是抗氧化酶系統(tǒng),包括SOD、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等,另一類是非酶抗氧化系統(tǒng),由許多具有抗氧化能力的非酶類物質(zhì)組成。以上抗氧化系統(tǒng)協(xié)同負責將ROS從高活性的自由基轉(zhuǎn)化成低活性分子,從而阻止ROS轉(zhuǎn)化成更具危害性的物質(zhì),降低對細胞的氧化損傷[22,23]。以槲皮素為代表的天然抗氧化功能因子具有清除自由基及上調(diào)機體抗氧化酶系統(tǒng)活性的作用,對機體氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)有積極意義[24]。但隨著研究的深入,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)包括槲皮素在內(nèi)的部分黃酮類化合物,在高濃度、長時間作用時發(fā)揮促氧化作用,會造成機體ROS水平升高,抗氧化酶活性下降等。槲皮素清除自由基的中間產(chǎn)物具有生物毒性,可能是導致其促氧化作用出現(xiàn)的原因之一[25,26]。

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個復雜的病理過程,涉及多條信號通路的交互作用,因此尋找可靠的抗癌靶點以及明確抗癌藥物的作用機制意義重大。ROS等自由基誘導機體產(chǎn)生的氧化應激與人體多種慢性疾病,包括癌癥的發(fā)生發(fā)展關系密切[27]。除ROS外,在氧化應激過程中的丙二醛(MDA)是ROS與細胞膜磷脂的不飽和脂肪酸反應形成的物質(zhì),是評價氧化應激的一個非常重要的指標。對SOD的檢測和評價是作為氧化應激和抗氧化最常用的另一指標[28]。在絕大多數(shù)情況下,槲皮素具有抗氧化活性[6]。為了明確槲皮素對宮頸癌中氧化應激的影響,本研究檢測了各組細胞內(nèi)ROS、MDA含量以及T-SOD活力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)20 μmol/L及以上濃度的槲皮素處理細胞48 h,可以明顯上調(diào)ROS、MDA水平,降低T-SOD活力,說明該實驗條件下槲皮素對正常HeLa細胞發(fā)揮促氧化作用。以上研究結(jié)果與在肝癌中的研究結(jié)果類似[29],證實高濃度槲皮素作用時間長時可發(fā)揮明顯的促氧化效應。由于槲皮素能明顯誘導HeLa細胞凋亡,而ROS的增多與細胞凋亡有關[19,30],我們推測槲皮素誘導HeLa細胞凋亡的機制可能與其促氧化效應有關。

綜上所述,本研究提示槲皮素能夠通過誘導凋亡、抑制遷移抑制宮頸癌細胞生長,且呈劑量依賴性,其機制可能與槲皮素促進細胞內(nèi)氧化應激有關。不過,槲皮素對HeLa的作用是否與促氧化直接相關,二者之間的因果關系如何還需要進一步驗證。另外,體外細胞實驗結(jié)果不能完全反映體內(nèi)真實情況,還有待于在宮頸癌動物模型甚至患者中進行觀察,為將槲皮素用于宮頸癌的臨床治療提供理論依據(jù)。