miRNA-145過表達增強卵巢癌順鉑化療敏感性的機制分析

丁照黎，谷見法，張飛翔

鄭州大學附屬鄭州中心醫院腫瘤科，鄭州 450003

卵巢癌是女性常見的生殖系統惡性腫瘤，發病率僅次于子宮頸癌及子宮體癌，其中有超過90%的患者屬于卵巢上皮癌，而卵巢上皮癌是婦科生殖系統惡性腫瘤中病死率最高的疾病[1]。順鉑是卵巢癌常用化療藥物，但是抗腫瘤效果并不理想，而影響卵巢癌患者順鉑化療效果的危險因素有患者依從性、用藥劑量和頻率以及惡性腫瘤細胞對順鉑的耐藥性等。卵巢癌細胞對順鉑的耐藥性是其重要的自我保護機制，但是對患者的近期療效及遠期生存均可帶來嚴重的不良影響，需要積極探討耐藥機制的產生原因及增強敏感性的方案才能增強卵巢癌順鉑化療的效果[2]。miRNA是近年來惡性腫瘤領域研究的熱點，越來越多的研究證實其與抑癌/促癌存在緊密的關系[3-5]。miRNA-145最初是在結腸癌中被發現，并且其表達水平明顯低于癌旁正常組織，推測其與惡性腫瘤細胞的增殖、凋亡有關[6]。另有研究顯示，miRNA-145的表達與肝癌患者化療效果存在緊密關聯，推測其表達能夠調控肝癌化療的敏感性[7]。多藥耐藥基因1（multi-drug resistance gene 1，MDR1）為常見的多藥耐藥基因，在人卵巢癌順鉑耐藥中發揮重要的作用，有研究認為MDR1能夠調節P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）表達，進而影響腫瘤細胞對順鉑的耐藥性[8]。P-gp蛋白位于人類7號染色體長臂上，相對分子量高達170 000，由2個分子結構基本相同的亞基組成，各包含1個ATP結合位點和6個跨膜區，在卵巢癌順鉑化療中也有參與且發揮重要作用[9]。但是miRNA-145在卵巢癌中的表達、其與順鉑化療敏感性的關系及對MDR1、P-gp蛋白的表達是否有調控作用仍需要進一步探討。故此，本研究特選取人卵巢癌順鉑耐藥細胞株A2780/DDP進行體外實驗，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢癌順鉑耐藥細胞株A2780/DDP購自中國醫學科學院腫瘤醫院細胞中心。

1.2 主要試劑及設備

胎牛血清、RPMI1640培養基均購自江蘇恩莫阿賽生物技術有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）購自武漢博士德生物工程有限公司；四唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolim，MMT）溶液、二甲亞砜溶液均購自齊一生物科技（上海）有限公司；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）購自上海睿鉑賽生物科技有限公司；RNA及蛋白提取試劑盒均購自美國Bio-Rad公司；Lipofectamine 2000脂質體、無關干擾序列、miRNA-145-5p mimics均購自寶生物（大連）科技有限公司；人抗鼠P-gp單克隆抗體、鼠抗兔P-gp多克隆抗體均購自亞諾法生技股份有限公司。3111型二氧化碳（CO2）培養箱購自美國Thermo公司；DMIL型倒置熒光顯微鏡購自德國Leica公司；FV1200型激光共聚焦顯微鏡購自日本Olympus公司；5810R型臺式高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司；6孔細胞培養板購自美國Fisher Scientific公司；1500型酶標儀購自美國Thermo公司；CFX-96型聚合酶鏈反應擴增儀購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像分析系統購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞的傳代培養、分組及干預方法 人卵巢癌順鉑耐藥細胞株A2780/DDP用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基于37℃、5% CO2培養箱中培養。倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，直至對數生長期時，以1.5×106/孔分裝至6孔板，分為Blank組、Mock組、NC組和轉染組4組，每組均設置5個復孔，均給予75 μmol/L（半數抑制濃度）的順鉑。采用Lipofectamine 2000脂質體轉染法進行轉染，嚴格按照說明書步驟操作，Mock組加入轉染試劑即Lipofectamine 2000，NC組加入無關干擾序列，轉染組逐滴加入miRNA-145-5p mimics質粒、脂質體混合液，Blank組加入等量生理鹽水，分別在RPMI1640培養基中培養24 h后更換細胞培養液，繼續培養24 h。

1.3.2 轉染情況觀察 分別于培養24、48 h后采用倒置熒光顯微鏡觀察各組細胞的轉染情況。

1.3.3 miRNA-145、MDR1mRNA表達水平檢測于培養48 h后對各組細胞采用實時定量聚合酶鏈反應（real time-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測，首先用PBS液沖洗，分別加入200 μl PBS+500 μl Buffer RLT，混合均勻后加入 5 μl β-巰基乙醇。加入 600 μl濃度為 70%的乙醇，采集 1000 μl混合液離心分離（12 000 r/min，15 min），取所得樣品加入Buffer RW1，再次相同方法離心，加入500 μl RPE液再次相同方法離心，轉移濾柱后離心（13 000 r/min，2 min），轉移濾柱，加入Rnase-free水，靜置后離心（12 000 r/min，15 min）。采用RNA提取試劑盒處理并進行逆轉錄，待合成cDNA后，將β-actin作為參照實施擴增實驗。miRNA-145引物，上游：5'-TACTGATATCGTAGGACGCTACGTGCT-3'，下游：5'-GTGTACCTGATGTATTACGACTGGCCA-3'；MDR1引物，上游：5'-TGTAATCTTGCGAACGCGTCAAGTCTG-3'，下游：5'-TGTACGC-TATATGTTGGACTAGCCAGC-3'；β-actin引物，上游：5'-GAGTACTCTCTAAGGCGTCGTATAGCT-3'，下游：5'-TACGTATAGCTCGGGTTAACTCTACGG-3'。利用PCR擴增儀進行擴增反應，50℃預變性 1 min，95 ℃變性30 s，56 ℃反應50 s，72 ℃反應30 s，合成互補鏈，進行35個循環。利用PCR儀內置功能獲取實驗數據。實驗重復3次，取均值。

1.3.4 細胞增殖活性檢測 采用MTT比色法檢測細胞培養24、48 h后的增殖活性，每孔分別加入20 μl MTT溶液，培養4 h后將培養液撇去，加入150 μl二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液，輕輕吹打直至溶液澄清，測定490 nm處的光密度值（optical density，OD），即為增殖活性。實驗重復3次，取均值。

1.3.5 細胞核形態學變化及凋亡率檢測 分別于細胞培養24、48 h后采用DAPI檢測細胞核形態學變化并計算凋亡率，在細胞達到80%融合時繼續培養，放去培養液，并用 PBS 洗滌，加入 1 μg/ml的DAPI，37℃培養于CO2培養箱中，避光孵育后再次用PBS沖洗，注意遮光操作，利用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞核的形態學變化，并計算細胞凋亡率，細胞凋亡率=凋亡細胞數/細胞總數×100%。實驗重復3次，取均值。

1.3.6 P-gp 蛋白表達檢測 采用蛋白質免疫印跡法（Western blot，WB）檢測，以試劑盒提取總蛋白并進行定量，上樣，每孔上樣量為20 μl，進行電泳分離，然后轉膜1.5 h，用脫脂奶粉搖床，4℃封閉24 h，加入一抗，27℃搖床孵育，2 h后洗滌，并加入二抗，27℃孵育1 h，暗室中顯色。以P-gp蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值記為P-gp蛋白的相對表達量。實驗重復3次，取均值。

1.4 統計學分析

采用SPSS 24.0軟件進行統計分析，計數資料以例數及率（%）表示；計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，兩組比較采用配對t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-145轉染情況的比較

培養24、48 h時NC組、Blank組、Mock組均無轉染陽性細胞，而轉染組陽性細胞轉染率均較高（圖1），分別為（28.12±1.86）%、（85.41±2.01）%，差異有統計學意義（t=46.778，P=0.000）。

2.2 培養48h時miRNA-145、MDR1mRNA表達水平的比較

各組細胞培養48 h時miRNA-145、MDR1mRNA表達水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）；其中NC組、Blank組、Mock組細胞miRNA-145表達水平均低于轉染組，而MDR1mRNA表達水平均高于轉染組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

圖1 轉染組轉染24、48h的熒光結果（×100）

表1 各組細胞培養48 h時miRNA-145、MDR1 mRNA表達水平的比較（±s）

表1 各組細胞培養48 h時miRNA-145、MDR1 mRNA表達水平的比較（±s）

注：*與轉染組比較，P＜0.05

m i R N A-1 4 5表達0.7 8±0.1 1 0.5 0±0.1 1*0.5 2±0.1 0*0.5 1±0.1 2*7.5 2 7 0.0 0 2 0.4 2±0.1 1 0.5 6±0.1 2*0.5 8±0.1 3*0.5 7±0.1 2*7.4 0 1 0.0 0 4轉染組N C組B l a n k組M o c k組F值P值M D R 1 m R N A表達組別

2.3 細胞增殖活性的比較

各組細胞培養24、48 h時OD值比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；各組細胞培養48 h時OD值均高于培養24 h時，且同一時刻轉染組OD值均低于NC組、Blank組、Mock組細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05）；而同一時刻NC組、Blank組、Mock組OD值比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 培養24、48 h時各組細胞OD值的比較（±s）

表2 培養24、48 h時各組細胞OD值的比較（±s）

注：a與同時間轉染組比較，P＜0.05；b與本組培養24 h比較，P＜0.05

培養4 8 h 0.7 0 1±0.0 8 1 b 0.8 2 5±0.0 6 8 a b 0.8 2 3±0.0 6 9 a b 0.8 2 1±0.0 6 5 a b 4.1 0 1 0.0 2 5 0.4 0 2±0.0 9 7 0.6 1 0±0.0 7 0 a 0.5 9 8±0.0 7 2 a 0.6 1 1±0.0 6 9 a 8.6 3 6 0.0 0 1轉染組N C組B l a n k組M o c k組F值P值培養2 4 h組別

2.4 細胞核形態學變化、細胞凋亡率的比較

各組細胞均有細胞核濃縮、變小等形態學表現，且染色質無規律分布、邊界不清或染色質集中于核膜且呈新月狀，細胞膜不完整，培養48 h時細胞核形態學變化均比培養24 h時更為嚴重，同一時刻細胞核形態學變化比較，NC組、Blank組、Mock組細胞形態學相近，轉染組細胞核形態學變化均較上述3組嚴重改變（圖2）。培養48 h時各組細胞凋亡率均明顯高于培養24 h時，且各時間NC組、Blank組、Mock組細胞凋亡率均低于轉染組，差異均有統計學意義（P＜0.05）（表3）。

2.5 培養48h時P-gp 蛋白相對表達量的比較

圖2 培養24、48h 各組細胞核形態學變化（DAPI染色，×200）

表3 培養24、48 h時各組細胞凋亡率的比較（%，±s）

表3 培養24、48 h時各組細胞凋亡率的比較（%，±s）

注：a與同時間轉染組比較，P＜0.05；b與同時間NC組比較，P＜0.05；c與同時間Blank組比較，P＜0.05；d與本組培養24 h比較，P＜0.05

組別轉染組N C組B l a n k組M o c k組F值P值2 1.7 7±2.5 8 1 3.2 2±2.2 3 a 1 3.2 6±2.1 9 a 1 4.3 0±2.2 4 a b c 9.4 9 4 0.0 0 5 4 6.9 9±2.9 6 d 3 6.7 1±2.6 5 a d 3 6.7 2±2.7 2 a d 3 7.4 9±2.6 8 a b c d 9.9 6 6 0.0 0 4培養2 4 h 培養4 8 h

各組細胞培養48 h后P-gp蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；且NC組、Blank組、Mock組細胞P-gp蛋白相對表達量均高于轉染組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表4、圖3）

表4 各組細胞培養48 h時P-gp蛋白相對表達量的比較（±s）

表4 各組細胞培養48 h時P-gp蛋白相對表達量的比較（±s）

注：*與轉染組比較，P＜0.05

組別轉染組NC組Blank組Mock組F值P值P-gp蛋白相對表達量20.44±4.16 86.42±5.03*85.90±5.09*86.23±5.13*227.897 0.000

3 討論

圖3 各組細胞培養48h后P-gp 蛋白表達情況

目前人們對卵巢癌的發生機制認識尚淺，大致可以將其分為外部因素和內部因素，其中前者主要包括物化致癌因子接觸，后者主要包括遺傳、基因突變、精神因素以及免疫功能異常等，需進行深入研究。卵巢癌化療耐藥性一直是國內外醫學研究人員普遍關注的重點。既往研究表明，卵巢癌化療耐藥是惡性腫瘤細胞的自我保護機制，能夠減輕細胞受損甚至是避免細胞損傷，使得惡性腫瘤細胞異常增殖，并且難以有效控制[10-11]。因此如何采取有效手段以增強卵巢癌細胞對化療的敏感性仍是目前亟待解決的問題。目前臨床常用的增敏劑有甘氨雙唑鈉、奧拉帕尼等，雖然有確切的近期療效，但是遠期效果仍不甚理想，究其原因主要為對卵巢癌化療耐藥的機制認識尚淺且缺乏特異性的干預手段。

本研究中，轉染組在培養24、48 h時經過熒光倒置顯微鏡觀察可知，細胞轉染率明顯升高，而其余3組均未見細胞轉染，證實轉染組miRNA-145轉染成功。此外，本研究還顯示轉染組miRNA-145的表達水平明顯高于NC組、Blank組、Mock組，與上述倒置熒光顯微鏡觀察轉染的結果相一致，證實轉染組miRNA-145的表達水平的確較高。轉染組細胞培養24、48 h時增殖活性均低于NC組、Blank組、Mock組，細胞凋亡率均高于NC組、Blank組、Mock組，且轉染組細胞培養48 h時的增殖活性和細胞凋亡率均高于本組培養24 h時，表明轉染miRNA-145、滴加順鉑化療藥物的人卵巢癌順鉑耐藥細胞株的增殖活性可顯著降低，細胞凋亡率則會明顯升高，證實miRNA-145過表達能夠增強卵巢癌順鉑化療的敏感性，從而抑制惡性腫瘤細胞增殖，促進惡性腫瘤細胞凋亡。miRNA-145屬于一種抑癌基因，對惡性腫瘤細胞生長和增殖的抑制作用可能是通過抑制癌基因表達、促進腫瘤細胞凋亡、調控細胞周期實現的[12]。原癌基因激活是卵巢癌細胞快速增殖的重要條件，而miRNA-145能夠多靶向抑制多個癌基因的表達，包括佛氏白血病病毒整合蛋白1（friend leukemia integration 1 transcription factor，FLI1）、胰島素受體底物 1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）等[13]。有研究表明，miRNA-145能夠發揮周期阻滯的環路作用，有助于調控細胞之間的增殖和凋亡平衡[14-15]。由此可知，miRNA-145對卵巢癌細胞具有抑制增殖、促進凋亡的作用，但是關于其對卵巢癌順鉑化療敏感性的研究尚鮮有報道。本次研究通過對各組細胞不同時間的細胞核形態學變化觀察結果顯示，miRNA-145轉染后細胞核出現嚴重的形態學改變，且培養48 h時的形態學改變明顯較培養24 h后的形態學改變嚴重，而順鉑殺滅卵巢癌細胞的作用機制便是誘導細胞核發生形態學改變[16]，促進其凋亡，抑制增殖。故此，結合上述分析和本研究結果可以發現，miRNA-145過表達本身具有抑制卵巢癌細胞增殖、促進其凋亡的作用，但與此同時該干預方法還可增強卵巢癌細胞對順鉑化療的敏感性，間接抑制惡性腫瘤細胞增殖、促進其凋亡。

本研究中，各組MDR1mRNA表達水平比較有顯著性差異，其中轉染組水平最低，推測miRNA-145過表達能夠降低MDR1的表達水平；在P-gp蛋白相對表達量的比較結果中，轉染組最低，而NC組、Blank組、Mock組均高于轉染組，推測miRNA-145過表達的人卵巢癌順鉑耐藥細胞株中P-gp蛋白表達可能受到顯著抑制。P-gp蛋白主要存在于耐藥惡性腫瘤細胞的細胞膜上，能夠與ATP結合，并且據此獲得能量，進而發揮藥物泵的功能，促進細胞內存在的化療藥物快速排出，減少惡性腫瘤細胞內化療藥物的積聚，減輕甚至避免細胞核由于受到損傷而發生形態學變化[17]。既往研究顯示，在人肝癌細胞株SMMC-7721中，在添加順鉑后給予增敏劑干預，結果發現增敏劑干預組細胞的P-gp蛋白表達量顯著降低，而空白對照組的P-gp蛋白持續處于較高水平，證實P-gp蛋白的表達水平越高，惡性腫瘤細胞對順鉑化療的敏感性越差，而P-gp蛋白的表達水平越低，惡性腫瘤細胞對順鉑化療的敏感性越高[18]。由此可知，P-gp蛋白表達與惡性腫瘤細胞順鉑化療的敏感性呈明顯負相關。類似的結論在國外Falzone等[19]的報道中也得到證實。miRNA-145過表達能夠下調MDR1基因的表達，而該基因的表達產物便是P-gp蛋白，因此miRNA-145過表達能夠降低P-gp蛋白的表達水平，從而增強細胞株對順鉑的敏感性，改善抗腫瘤效果。結合本研究結果與上述分析，推測miRNA-145過表達很可能是通過降低P-gp蛋白的表達增強人卵巢癌順鉑耐藥細胞株A2780/DDP對順鉑的敏感性，但是具體調控機制仍有待深入探討。

綜上所述，miRNA-145過表達能夠抑制人卵巢癌順鉑耐藥細胞株A2780/DDP增殖，促進其凋亡，還可導致細胞核出現嚴重的形態學改變，推測與降低P-gp蛋白表達、增強腫瘤細胞對順鉑化療的敏感性有關，但是具體機制仍有待深入探討，可作為進一步研究的方向。