胃癌相關(guān)分子分類的研究進(jìn)展

高青，莊麗維

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院消化內(nèi)科，哈爾濱 150001

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)的報(bào)告指出，2018年全球惡性腫瘤死亡人數(shù)預(yù)計(jì)為960萬（不包括非黑色素瘤皮膚癌），其中胃癌死亡人數(shù)為78萬，即每12個(gè)因惡性腫瘤死亡的患者中就有1例死于胃癌，使其成為世界第三大癌癥死亡原因，以及第五位最常被診斷的癌癥[1]。無論是新發(fā)病例還是死亡病例，男性均是女性的兩倍。盡管目前中國胃癌的發(fā)病率仍然遠(yuǎn)高于英國和美國，較之前卻有所下降。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2000—2011年，胃癌在中國的發(fā)病率每年下降1.8%～5.5%[2]，但病死率下降不明顯，5年總生存率很低，2013—2015年胃癌患者5年生存率＜35%[3]。2018年，中國消化道癌占中國癌癥總死亡人數(shù)的36.4%，而在美國及英國該比例不超過5%；胃癌死亡人數(shù)在消化道癌中占37.4%，是中國消化道癌的主要死亡原因[4]。這些可能與中國較低的早期癌癥檢出率及不同地區(qū)提供的不夠標(biāo)準(zhǔn)的治療策略有關(guān)。胃癌的危險(xiǎn)因素主要有幽門螺桿菌、EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染、遺傳、環(huán)境、飲食及生活習(xí)慣等。對胃癌分子特性的研究不僅可以幫助提高早期診斷率，明確治療策略，還有助于對發(fā)病機(jī)制的研究。本文通過對胃癌不同分子分類亞型的特性及其在臨床中的研究進(jìn)行綜述，為胃癌的早期診斷及精準(zhǔn)治療提供思考和借鑒。

1 胃癌的不同分子分類體系

在全基因組特征研究之前，Ottini等[5]提出了自己的分類，隨后Tan等[6]和Lei等[7]基于基因的特征在經(jīng)過一系列的研究之后提出了新的分子分類。隨著分子基因技術(shù)的發(fā)展，研究者們對胃癌分子特性的研究更加深入，癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）、亞洲癌癥研究組織（Asian Cancer Research Group，ACRG）等分子分類體系被進(jìn)一步提出。

1.1 TCGA 的分子分類體系

2014年，TCGA研究網(wǎng)絡(luò)基于6個(gè)分子平臺(tái)對295例胃腺癌進(jìn)行了鑒定：通過體細(xì)胞拷貝數(shù)分析、全外顯子組測序、DNA甲基化譜、信使RNA測序、微小RNA測序和反相蛋白陣列技術(shù)、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測和全基因組測序，最后將胃癌綜合鑒定為4種分子亞型，分別為EBV陽性、微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite unstable，MSI）、基因組穩(wěn)定（genomically stable，GS）和染色體不穩(wěn)定（chromosomally unstable，CIN）。在該項(xiàng)研究隊(duì)列中，不同亞型發(fā)病率依次為EBV（9%）、GS（20%）、MSI（22%）、CIN（50%）[8]。

EBV相關(guān)胃癌在全球每年發(fā)生75 000～90 000例，發(fā)病率為1.3%～30.9%，全球平均發(fā)病率為10%，為EBV腫瘤中占比最大的亞群[9-10]。EBV多見于男性（81%），MSI中女性（56%）略占優(yōu)勢。不同國家之間各亞型的患病率具有顯著差異：MSI、EBV和GS亞型之間的差異超過5倍[8]。對以上亞型在各國發(fā)病率的高度差異的研究可以確定特定分子亞型背后的分子和環(huán)境因素對胃癌發(fā)病的影響[11]。EBV多位于胃底或胃體，食管胃交界腺癌中CIN的發(fā)生率較高，MSI一般為腸型胃癌，彌漫型胃癌在GS中富集。

EBV的分子特性表現(xiàn)為廣泛的DNA啟動(dòng)子的高甲基化，磷脂酰肌醇4，5-二磷酸3-激酶催化亞基α亞型（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform，PIK3CA）的反復(fù)突變，酪氨酸受體激酶JAK2、程序性死亡受體配體 1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）和程序性死亡受體配體2（programmed cell death 1 ligand 2，PDCD1LG2，也稱PD-L2）的擴(kuò)增，超過50%的EBV陽性腫瘤中存在富含AT的交互式領(lǐng)域蛋白1A基因（AT-rich inter-active domain-containing protein 1A，ARID1A）突變，很少有腫瘤蛋白p53基因的突變。MSI表現(xiàn)為高突變負(fù)擔(dān)，如DNA非整倍性、染色體的結(jié)構(gòu)變化（如易位）以及各種原癌基因、腫瘤抑制基因的突變和高甲基化，尤其是作為錯(cuò)配修復(fù)缺陷最常見原因的DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白mutL同源物1（mutL homolog 1，MLH1）基因的啟動(dòng)子高甲基化[8,12]。通常使用5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記確定MSI微衛(wèi)星序列長度變化的累積[13]，根據(jù)不穩(wěn)定標(biāo)記的數(shù)量，將MSI分為高M(jìn)SI（MSI-H）（≥2/5不穩(wěn)定標(biāo)記）和低MSI（MSI-L）（1/5不穩(wěn)定標(biāo)記）。沒有不穩(wěn)定標(biāo)記的腫瘤被認(rèn)為是微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stable，MSS）的。在7%～24%的胃癌中可檢測到MSI-H與DNA錯(cuò)配修復(fù)缺陷有關(guān)[14-15]。MSI-L表型在包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤中均有發(fā)現(xiàn)，但其生物學(xué)和臨床意義尚不明確，MSI-L和MSS腫瘤常被合并為一組[16-17]。GS亞型通常顯示負(fù)責(zé)細(xì)胞黏附的基因發(fā)生突變，如Ras同系物家族成員A基因（Ras homolog family member A，RHOA）、1型鈣黏蛋白基因（cadherin 1，CDH1）和緊密連接蛋白18-Rho GTPase激活蛋白融合基因（claudin 18-rho GTPase activating protein，CLDN18-ARHGAP）。CIN表現(xiàn)為非整倍性和受體酪氨酸激酶的局灶性擴(kuò)增，并在TP53突變中富集。研究者發(fā)現(xiàn)CIN亞型患者輔助化療獲益最大，GS亞型患者獲益最少[18]。盡管MSI對氟尿嘧啶無反應(yīng)，輔助化療對該亞型患者缺乏明顯益處，但較低的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率使其能代表良好的預(yù)后[19-23]。雖然EBV陽性與胃癌患者的生存預(yù)測無明顯相關(guān)性[15,24]，但其對術(shù)后輔助化療的獲益具有一定提示作用：一項(xiàng)包含了760例胃或胃食管交界處（gastroesophageal junction，GEJ）腺癌患者的研究通過分析基于鉑/5-氟尿嘧啶的術(shù)前化療下EBV和MSI對胃癌和胃食管交界癌的診斷和預(yù)后預(yù)測意義，發(fā)現(xiàn)盡管MSI-H和EBV陽性不能預(yù)測鉑/5-氟尿嘧啶的術(shù)前化療的療效，卻可以提示良好的預(yù)后，而且MSI-H在不同的治療方法中都可以代表良好的預(yù)后[25]。MSI-L可以提示單純手術(shù)治療患者的不良預(yù)后和術(shù)前對化療的良好反應(yīng)，因此MSI-L能幫助識(shí)別在術(shù)前接受鉑/5-氟尿嘧啶治療中獲益的患者。西方國家對進(jìn)展期胃癌患者采用含鉑/5-氟尿嘧啶聯(lián)合化療的術(shù)前圍手術(shù)期化療，但療效有限[26-27]，或許研究者們應(yīng)該在了解不同個(gè)體的分子特性的基礎(chǔ)上制定最佳治療計(jì)劃。相較而言，CIN和MSI亞型的總體生存率高于GS亞型，但低于EBV亞型[24,28-29]。TCGA分型提高了對發(fā)病機(jī)制及分子驅(qū)動(dòng)的認(rèn)識(shí)，學(xué)者們對各亞型后續(xù)的研究為該分類體系補(bǔ)充了預(yù)后信息。

1.2 ACRG 的分子分類體系

2015年，ACRG通過收集一家韓國轉(zhuǎn)診醫(yī)院的患者，應(yīng)用基因表達(dá)數(shù)據(jù)將胃癌分為四種亞型：MSI、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、MSS/TP53陽性（MSS/TP53+）和MSS/TP53陰性（MSS/TP53-）[30]。MSS/TP53+亞型與EBV感染有關(guān)。MSI組以MLH1缺失，多個(gè)致癌基因發(fā)生突變?yōu)樘卣鳌SS和EMT具有表達(dá)EMT相關(guān)基因以及CDH1缺失的特征。通過對EMT亞型突變基因的研究發(fā)現(xiàn)EMT中的彌漫型患者的CDH1突變與生存期縮短有關(guān)，與疾病分期無關(guān)[31]。由于TP53是胃癌中最常見的突變基因，基于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）基因和MDM2原癌基因（MDM2 proto-oncogene，MDM2）的TP53活性信號在TP53完整的腫瘤中得分較高，而在TP53功能喪失的腫瘤中得分較低。可以將MSI和EMT以外的腫瘤分為MSS/TP53+和MSS/TP53-亞型。在MSS/TP53-樣本的隊(duì)列中，TP53突變發(fā)生率最高，ARID1A、PIK3CA、WNT信號通路的APC調(diào)節(jié)器基因（APC regulator of WNT signaling pathway，APC）、鼠類肉瘤病毒癌基因（KRAS proto-oncogene，KRAS）、SMAD家族成員4（SMAD family member 4，SMAD4）等基因的突變也較常見，且樣本的非整倍性更高，癌基因如酪氨酸激酶2型受體基因（Erb-B2 receptor tyrosine kinase 2，ERBB2）的擴(kuò)增更多。對EMT亞型的輔助化療或檢查點(diǎn)阻斷并沒有明顯的獲益，可能是由于MSS/EMT患者診斷時(shí)多為晚期。在生存分析中，EMT患者預(yù)后最差，其次為TP53-腫瘤、TP53+腫瘤，最后為MSI腫瘤[30]。未來進(jìn)展期胃癌的靶向治療和免疫治療的臨床試驗(yàn)或許可以根據(jù)基因組或免疫學(xué)特征的差異進(jìn)行設(shè)計(jì)，因?yàn)樗鼈兛赡苡绊懼委煼磻?yīng)和臨床結(jié)果。ACRG描述的分型與明顯的基因組改變、生存結(jié)局和術(shù)后復(fù)發(fā)模式相關(guān)。

1.3 通過新一代基因測序技術(shù)提出的分類體系

Li等[32]在對544例胃癌患者基因測序研究后提出了一種新的基于突變負(fù)擔(dān)和突變模式的胃癌分類，他們發(fā)現(xiàn)不同分子亞型胃癌發(fā)病機(jī)制存在普遍而特異的突變過程，突變負(fù)擔(dān)也不同，高突變胃癌表現(xiàn)出明顯的MSI性，通過對8個(gè)顯著突變基因：TP53、ARID1A、CDH1、PIK3CA、RHOA、APC、ERBB2和含2個(gè)新肌動(dòng)蛋白結(jié)合重復(fù)序列基因（xin actin binding repeat containing 2，XIRP2）的區(qū)分得到C1和C2兩組，系統(tǒng)分析后發(fā)現(xiàn)，C1組中TP53基因突變較多，C2組中ARID1A基因突變的比例較高。C2組還具有更多定位于胃體及彌漫型胃癌的特征。與TCGA分子亞型比較后發(fā)現(xiàn)C1組中CIN亞型更豐富，C2組中GS亞型和CIN亞型分布均勻。由于C1組與更好的預(yù)后結(jié)果相關(guān)，因此C1、C2亞型也可作為胃癌的預(yù)后因子。Li等[32]提出的分類代表了未來分子分類的一種方向，C1、C2亞型對胃癌治療及預(yù)后的價(jià)值還需要進(jìn)一步的探索。

1.4 GEJ腫瘤的分子分類體系

GEJ腫瘤分為食管癌和胃癌，這兩種類型癌癥在GEJ的區(qū)分比較困難。GEJ腫瘤的發(fā)病率在過去的50年里迅速增長，因此對該部位腫瘤進(jìn)行明確的分類越來越重要。第8版美國癌癥聯(lián)合會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）/國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control，UICC）癌癥分期手冊對GEJ腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)的選擇做出了如下定義：若腫瘤侵及胃食管交界線且腫瘤中心位于胃食管交界線以下不超過2 cm的范圍，采用食管癌分期標(biāo)準(zhǔn)，若累及胃食管交界線但腫瘤中心位于胃食管交界線以下2 cm以外，以及未累及胃食管交界線的腫瘤，采用胃癌分期方法[33]，這也代表了GEJ腫瘤的解剖分類。這種分類方法雖然考慮了腫瘤的位置以指導(dǎo)最佳手術(shù)方式，卻忽略了腫瘤的生物學(xué)特性。Bornschein等[34]用Illumina-HTv4.0芯片檢測107例初治腸型胃食管腺癌患者的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了3種不同的分子亞型，它們與解剖位置、腫瘤分期或分級無關(guān)，只與表達(dá)的關(guān)鍵通路有關(guān)：第一種亞型上調(diào)了可以增加黏膜抵抗反流能力的胃特異性基因的表達(dá)；第二種亞型表達(dá)活躍在腸道和膽道相關(guān)代謝途徑的腸道特異性基因；第三種亞型的活性基因與炎癥調(diào)控相關(guān)。以上3種亞型在生物通路表達(dá)中的區(qū)別意味著這些差異可以為GEJ腫瘤的治療提供參考。對于解剖分類存在爭議的腫瘤，根據(jù)生物特性進(jìn)行分類或許是一個(gè)可以考慮的選擇。

2 TCGA、ACRG 分子分類研究進(jìn)展

Li等[32]和Bornschein等[34]提出的分子分類有待進(jìn)一步研究，TCGA和ACRG分子分類的臨床價(jià)值已經(jīng)被認(rèn)可，學(xué)者們將TCGA、ACRG分類與臨床常用的Lauren組織病理學(xué)分類聯(lián)系起來，從不同的角度探索分子亞型的臨床實(shí)踐。

2.1 TCGA、ACRG及Lauren分類的區(qū)別與聯(lián)系

通過對TCGA及ACRG分類中分子亞型的組織病理學(xué)及基因特征的歸納，發(fā)現(xiàn)雖然TCGA中的GS亞型和ACRG中的EMT亞型均以彌漫型為主（分別為75%和80%），但是，一方面這兩種分類體系中的其他亞型的彌漫型分布有所不同：ACRG中非EMT亞型彌漫型腫瘤的發(fā)生率為30%～46%，而TCGA中非GS亞型彌漫型腫瘤的發(fā)生率則小于25%[8,30]；另一方面，CDH1突變在TCGA的GS亞型中非常普遍（37%），但在ACRG的EMT亞型中并不常見（2.8%），TCGA的GS亞型特有的RHOA突變在ACRG的EMT亞型中也很罕見，而該突變在其他ACRG亞型中較EMT亞型更為常見。以上表明TCGA中的GS亞型和ACRG中的EMT亞型存在較大的差異。世界衛(wèi)生組織（WHO）分型中的差黏附性的腫瘤（包括部分或全部由印戒細(xì)胞構(gòu)成的腫瘤）對應(yīng)Lauren彌漫型類型，最近的一項(xiàng)研究描述了與其他類型的差黏附性腫瘤相比，印戒細(xì)胞為主的腫瘤中缺乏RHOA突變[35]。這從側(cè)面說明彌漫型胃癌與GS或EMT亞型沒有確切的對應(yīng)關(guān)系。盡管TCGA中的CIN亞型和ACRG中的MSS/TP53-亞型具有高度相似的結(jié)構(gòu)基因組改變，二者的基因擴(kuò)增都比較多，但是CIN亞型的基因擴(kuò)增明顯多于MSS/TP53-亞型。TCGA的CIN亞型多發(fā)生在胃近端，其發(fā)病率隨著近年來西方人群近端胃癌的發(fā)生率的上升而升高，而ACRG研究中近端胃癌發(fā)病率在降低，且Lauren彌漫型的比例比TCGA研究中較高。因此TCGA、ACRG與Lauren組織病理學(xué)分類是三種獨(dú)立存在的分類體系。

Birkman等[36]使用免疫組化和原位雜交技術(shù)對244例胃腺癌的分子特性進(jìn)行了歸納分析，在該隊(duì)列中：多見于男性的EBV陽性腸型腫瘤大多定位于胃體，大多數(shù)TP53異常的腸型腫瘤位于近端；所有MSI腫瘤均為腸型，且與總體生存率提高有關(guān)。幾個(gè)受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK），如ERBB2、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子（mesenchymal-epithelial transition factor，MET）和成纖維細(xì)胞生長因子2型受體（fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)GFR2），已報(bào)告在胃癌中擴(kuò)增[37]。2014年TCGA在所有EGFR或ERBB2基因擴(kuò)增的腫瘤中均觀察到腸型胃癌[8]。此次研究進(jìn)一步證實(shí)RTK擴(kuò)增在腸型腫瘤中更為普遍，所以在研究靶向治療胃癌的RTK時(shí)，組織學(xué)亞型可能是一個(gè)需要考慮的相關(guān)因素。綜上所述，在未來的臨床試驗(yàn)中，為了提高新的靶向治療所獲得的臨床效益，可能需要將組織學(xué)和分子分類方法協(xié)同應(yīng)用，以更好地指導(dǎo)臨床試驗(yàn)。

2.2 分子分類在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用研究

在TCGA的MSI和EBV亞型中，偶發(fā)性MSI胃癌的超突變特性和EBV陽性胃癌中常見的PD-L1擴(kuò)增使患者易于發(fā)生免疫檢查點(diǎn)阻斷[16,38-39]。MSI和EBV陽性的腫瘤對抗程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）的治療具有顯著反應(yīng)，總體反應(yīng)率分別為85%和100%[23]。因此MSI和EBV可以預(yù)測胃癌患者對免疫檢查點(diǎn)阻斷劑的反應(yīng)，是有用的生物標(biāo)志物[40]。AJCC建議胃癌和結(jié)直腸癌患者進(jìn)行MSI檢測[33]。盡管新一代測序技術(shù)可能是檢測MSI最敏感的方法，但是在臨床中錯(cuò)配修復(fù)蛋白的免疫組化檢測被認(rèn)為是最經(jīng)濟(jì)有效的方法，且聚合酶鏈反應(yīng)的結(jié)果與免疫組化的結(jié)果有很好的一致性。由此可見，基于潛在的治療及預(yù)后意義，在常規(guī)臨床實(shí)踐中將EBV的原位雜交和MSI的免疫組化檢測結(jié)果納入病理報(bào)告可能是有益的[40]。

3 小結(jié)與展望

從組織學(xué)和分子角度看，胃癌是一種異質(zhì)性疾病。目前組織病理學(xué)仍廣泛應(yīng)用于臨床，隨著新出現(xiàn)的系統(tǒng)治療方案和多模式治療概念在治療方法中越來越占優(yōu)勢，了解定義不同腫瘤亞型的生物學(xué)特性變得越來越重要。分子分類研究的發(fā)展讓學(xué)者們開始意識(shí)到在評估組織病理學(xué)的同時(shí)評估胃癌的分子特性，使其共同指導(dǎo)臨床決策的重要性。目前對TCGA、ACRG各分子亞型及臨床特性已經(jīng)有了初步的了解，新的分子亞型還在等待進(jìn)一步研究。隨著新一代基因測序技術(shù)的加入，未來的認(rèn)識(shí)會(huì)更加深入。這些認(rèn)識(shí)除了會(huì)進(jìn)一步改善分子分類體系以外，還能幫助發(fā)現(xiàn)不同分子亞型特異的標(biāo)志物，在精準(zhǔn)治療上更進(jìn)一步。目前分子分類在臨床中適用仍存在困難，除了需要進(jìn)一步證明各分子亞型的臨床意義以外，也需要考慮其較高的成本。因此，在確定某種分子亞型臨床價(jià)值的基礎(chǔ)上找到經(jīng)濟(jì)可行的普及方法也是將來需要面對的挑戰(zhàn)。