結直腸癌肝轉移患者射頻消融術后小核仁RNA宿主基因15變化及意義

郭新宇，田鵬，張鵬，劉毅，劉健康

河南省人民醫院普外科，鄭州 450000

近年來，中國結直腸癌發病率逐年升高，嚴重影響人們的身體健康[1]。肝臟是結直腸癌遠處轉移最為常見的器官[2]。相關研究表明，結直腸癌肝轉移后無治療生存期約5～12個月[3]，即使接受根治性切除術治療，仍有50%的患者因其他部位轉移或復發而死亡[4]。此外，結直腸癌患者發生多處轉移，很難通過根治性手術徹底切除。射頻消融術具有微創、安全及效果明顯等特點，已被廣泛應用于臨床實體腫瘤治療[5]。研究顯示，實體腫瘤患者經射頻消融術治療后恢復較快，且并無嚴重不良反應及并發癥[6]。目前，與根治性切除術相比，越來越多的肝癌、非小細胞肺癌等實體瘤患者更傾向于選擇射頻消融術治療。雖然射頻消融術可在一定程度上根治腫瘤，但仍有部分患者出現了復發或轉移，最終死亡[7]。因此，及時了解結直腸癌肝轉移患者預后情況對后續治療意義重大，但目前缺乏靈敏度和特異度均較高的生物標志物。

長鏈非編碼RNA（long chain non-coding RNA，lncRNA）是一類調控基因表達的不編碼蛋白質的RNA[8]。隨著測序技術和生物信息學的飛速發展，越來越多的lncRNA被證實與人體疾病有關。多項研究證實，HOX轉錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）、母系印記表達基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）和小核仁RNA宿主基因15（small nucleolar RNA host gene 15，SNHG15）等多個lncRNA參與了腫瘤的發生和發展過程[9-12]。SNHG15可轉錄8種小核仁RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）。本研究通過比較治療前后血清SNHG15相對表達量的變化，分析其與患者預后的關系，以期為結直腸癌肝轉移患者射頻消融術治療的預后評估提供參考，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2014年3月至2016年4月河南省人民醫院收治的58例結直腸癌肝轉移患者。納入標準：①原發腫瘤為結直腸癌，并經影像及病理學等檢查確診為肝轉移；②接受射頻消融術治療。排除標準：①接受放、化療、靶向治療、免疫治療及根治性手術治療等；②發生肝轉移以外的其他組織轉移；③合并自身免疫性疾病或血液系統疾病等；④臨床資料不完整。58例結直腸癌肝轉移患者中男42例，女16例；平均腫瘤直徑為（3.18±0.44）cm；腫瘤數目：單發43例，多發15例（2～3個，共計75個肝轉移瘤）；血管侵犯20例，無血管侵犯38例。本研究經本院醫學倫理委員會批準，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 射頻消融術 術前檢測患者血常規、血生化、凝血時間等。術中監測患者的血氧飽和度、血壓、脈搏和心率等?；颊咂脚P，消毒，鋪巾，1%利多卡因進行局部麻醉。在計算機斷層掃描（CT）引導下將射頻消融針穿刺至腫瘤中央，選擇適宜射頻電壓進行治療。治療后，觀察腫瘤是否完全消融，若腫瘤完全消融，調節為凝固模式，燒灼針道。術后給予鎮痛、抗感染及其他對癥治療等。

1.2.2 定量逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測血清SNHG15miRNA 的相對表達量 抽取結直腸癌肝轉移患者肘部靜脈血10 ml，3500 r/min，離心15 min，提取上層清液于離心管中，低溫保存，待驗。將Trizol試劑加入提取的血清中提取血清總RNA，若A260/A280為1.8～2.0，繼續后續實驗；提取總RNA，用逆轉錄試劑盒合成互補DNA（complementary DNA，cDNA），依據試劑盒說明書進行PCR擴增，反應條件：95 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，退火15 s，72 ℃ 45 s，40個循環。以GAPDH為內參，采用2-△△Ct計算SNHG15miRNA的相對表達量。SNHG15正向引物 5'-GGTGACGGTCTCAAAGTGGA-3'，反向引物 5'-CAGAGTTGGGGTCTCTGCAA-3'；GAPDH正向引物5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，反向引物5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'。

1.2.3 隨訪方法 采用復診、住院觀察及電話隨訪等方式于出院后1個月對患者開始隨訪，每月隨訪1次，隨訪4～36個月。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對所有數據進行統計分析，正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對t檢驗；結直腸癌肝轉移患者預后的影響因素采用Cox多因素分析；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線及曲線下面積（area under curve，AUC）評估SNHG15對結直腸癌肝轉移患者預后的診斷效能；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用Log-rank檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SNHG15miRNA 相對表達量的比較

射頻消融術治療前，結直腸癌肝轉移患者血清SNHG15miRNA的相對表達量為（2.86±0.67），明顯高于射頻消融術治療后結直腸癌肝轉移患者血清SNHG15miRNA的相對表達量（1.77±0.45），差異有統計學意義（t=11.604，P＜0.01）。

2.2 預后情況的比較

58例結直腸癌肝轉移患者1、2和3年的生存率分別為91.38%（53/58）、68.97%（40/58）和62.07%（36/58）。

2.3 SNHG15對結直腸癌肝轉移患者預后的診斷價值

經射頻消融術治療3年后，結直腸癌肝轉移患者生存36例，死亡22例，分別作為生存組和死亡組。生存組患者血清SNHG15miRNA相對表達量為（1.52±0.34），明顯低于死亡組患者的（2.17±0.30），差異有統計學意義（t=7.343，P＜0.01）。血清SNHG15診斷結直腸癌肝轉移患者預后的AUC為 0.924（95% CI：0.823～0.977），約登指數為0.722，其所對應的最佳截斷點、靈敏度和特異度分別為1.78、100.00%和72.22%。（圖1）

圖1 血清SNHG15診斷結直腸癌肝轉移患者預后的ROC曲線

2.4 SNHG15miRNA 相對表達量與結直腸癌肝轉移患者3年預后的關系

以SNHG15miRNA相對表達量為1.78為臨界值，SNHG15miRNA相對表達量＞1.78結直腸癌肝轉移患者（n=40）的平均總生存時間為18.61個月（95% CI：14.24～22.98個月），低于SNHG15miRNA相對表達量≤1.78結直腸癌肝轉移患者（n=18）的平均總生存時間34.10個月（95% CI：32.47～35.73個月），差異有統計學意義（χ2=37.107，P＜0.05）。（圖2）

圖2 SNHG15miRNA相對表達量＞1.78（n=40）與SNHG15 miRNA相對表達量≤1.78（n=18）結直腸癌肝轉移患者的生存曲線

2.5 結直腸癌肝轉移患者預后影響因素的單因素和多因素分析

將可能影響結直腸癌肝轉移患者預后的相關因素，如年齡、性別、腫瘤直徑、甲胎蛋白（α-fetal protein，AFP）水平、Child-Pugh分級、分化程度、腫瘤數目、血管侵犯情況及SNHG15miRNA相對表達量作為自變量，結直腸癌肝轉移患者的總生存時間作為因變量納入Cox單因素分析，結果顯示，AFP水平、分化程度、血管侵犯情況及SNHG15miRNA相對表達量可能與結直腸癌肝轉移患者的預后相關。將AFP水平、分化程度、血管侵犯情況及SNHG15miRNA相對表達量作為自變量，結直腸癌肝轉移患者的總生存時間作為因變量納入Cox多因素分析，結果顯示，血管侵犯情況和SNHG15miRNA相對表達量與結直腸癌肝轉移患者總生存時間密切相關。（表1）

表1 結直腸癌肝轉移患者預后影響因素的Cox單因素和多因素分析

3 討論

SNHG15位于7p13染色體[13]，已被證實參與多種腫瘤的發生發展過程，如胃癌、骨肉瘤等[14-15]。近年來，越來越多的lncRNA被證實與腫瘤臨床病理特征及預后有關[16-19]。研究顯示，胃癌患者SNHG15高表達，且與患者不良預后密切相關[20]。但關于SNHG15在結直腸癌肝轉移患者中的表達情況，是否與結直腸癌肝轉移患者預后相關仍不得而知。為此，本研究采用定量RT-PCR法檢測了結直腸癌肝轉移患者血清SNHG15的相對表達量，分析其與患者預后的關系。

本研究結果顯示，射頻消融術治療前，結直腸癌肝轉移患者血清SNHG15miRNA的相對表達量高于治療后血清SNHG15miRNA的相對表達量，表明SNHG15可能與肝轉移瘤有關。本研究通過對58例結直腸癌肝轉移患者進行跟蹤隨訪，了解其生存預后情況，并比較了不同預后患者血清SNHG15miRNA的相對表達量，結果發現，經射頻消融術治療后，生存組結直腸癌肝轉移患者血清SNHG15miRNA的相對表達量低于死亡組患者，推測SNHG15miRNA的相對表達量可能對評估結直腸癌肝轉移患者的預后具有重要價值。為驗證上述推斷，本研究采用ROC曲線評估SNHG15對結直腸癌肝轉移患者預后的診斷效能，結果發現，SNHG15miRNA的相對表達量診斷結直腸癌肝轉移患者預后的AUC為0.924，表明SNHG15診斷結直腸癌肝轉移患者預后的效能較高，具有一定臨床參考價值。此外，本研究還分析了不同SNHG15miRNA相對表達量的結直腸癌肝轉移患者生存時間，結果顯示，SNHG15miRNA相對表達量＞1.78的結直腸癌肝轉移患者平均總生存時間為18.61個月，低于SNHG15miRNA相對表達量≤1.78的結直腸癌肝轉移患者的平均總生存時間。上述結果表明SNHG15的相對表達量可能與結直腸癌肝轉移患者的生存時間有關。本研究采用Cox單因素及多因素回歸分析進一步探討結直腸癌肝轉移患者預后的影響因素，結果顯示，血管侵犯情況和SNHG15miRNA相對表達量與結直腸癌肝轉移患者總生存時間密切相關，SNHG15miRNA的相對表達量越高，結直腸癌肝轉移患者預后死亡風險越高。

綜上所述，結直腸癌肝轉移患者射頻消融術后SNHG15miRNA的相對表達量降低，其相對表達量與射頻消融術治療結直腸癌肝轉移患者的預后密切相關，檢測結直腸癌肝轉移患者血清SNHG15miRNA的相對表達量有助于評估患者的生存預后，為肝轉移瘤的靶向藥物研制提供了方向。本文雖證實SNHG15miRNA的相對表達量與結直腸癌肝轉移患者預后密切相關，但因樣本量有限，仍需進行大樣本、多中心研究，以避免樣本量小、個體差異及抽樣誤差所造成實驗結果的偶然性和隨機性。