響應面法優化半枝蓮總黃酮微波提取工藝及其體外活性研究

王潤坤，石紹奎，宋玲祥

（江蘇省盱眙縣人民醫院藥劑科，江蘇 淮安 211700）

半枝蓮Scutellaria barbataD.Don 為唇形科黃芩屬植物，以干燥全草入藥，收載于2015年版《中國藥典（一部）》［1］，具有清熱解毒、化瘀消腫、利尿止血功效。現代藥理學表明，半枝蓮還具有良好的抗腫瘤活性，臨床常用于治療癌癥、水腫、跌打損傷、黃疸等疾病［2-3］。半枝蓮的主要化學成分為黃酮類、生物堿類及甾體類化合物，以黃酮類化合物為主［4］。黃酮類化合物因具有良好的抗腫瘤、抗炎、抗氧化等活性，已成為現代天然產物研究的熱點［5］。現代藥理學研究表明，抗氧化劑能減少活性氧（ROS）自由基失衡所產生的生理、病理紊亂［6］，與化學合成抗氧化劑相比，天然抗氧化劑因具有活性突出、安全性好等特點而成為抗氧化劑領域的研究熱點，且部分植物的抗氧化活性部位被證實有較強的抗乙酰膽堿酯酶作用［7-8］，但半枝蓮總黃酮的相關研究尚無報道。與傳統提取方法相比，微波提取法具有提取時間短、提取步驟簡單、提取物得率高等優點［9］，廣泛用于中藥活性成分的提取分離。響應面法可通過回歸分析，高效地優化試驗數據［10］。目前，對于半枝蓮總黃酮提取工藝的研究主要集中在冷凝回流法，分析方法也多為正交試驗法［11］。本研究中采用響應面法探討提取次數、乙醇體積分數、料液比、微波提取時間、微波提取功率5 個主要影響因素對半枝蓮總黃酮得率的影響，并用二苯代苦味酰基（DPPH）自由基法、2，2-連氨- （3-乙基苯并塞唑啉-6-磺酸）二氨鹽（ABTS）自由基法測定其自由基清除活性，利用改良的Ellman 法評價抗乙酰膽堿酯酶活性，旨在為半枝蓮總黃酮微波提取工藝的優化及體外活性研究提供理論依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

U-3900 型紫外可見分光光度計（日本日立公司）；Synergy2 型酶標儀（美國博騰儀器公司）；RE-3000 型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；GHZ 型微波萃取器（北京國環高科自動化技術研究院）；FZ-102 型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

半枝蓮Scutellaria barbataD.Don 藥材由我院中藥房提供并由江蘇省盱眙縣人民醫院貢培麗副主任中藥師鑒定為正品；蘆丁對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號為wkq16101104）；維生素C（成都麥卡希化工有限公司，批號為2017041301）；DPPH 及ABTS 均購自梯希愛公司；乙酰膽堿酯酶、碘化硫代乙酰膽堿、二硫代二硝基苯甲酸、加蘭他敏，均購自美國Sigma-Aldrich公司；乙醇（國藥集團有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 蘆丁標準曲線繪制

精密吸取0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL 蘆丁標準品溶液（質量濃度為0.1 mg/mL），置10 mL 容量瓶中，參照文獻［12］的方法，以蘆丁標準溶液的質量濃度（C）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程A=11.91C-0.002 9，R2=0.999 8（n=6）。

2.2 半枝蓮總黃酮得率測定

取1 g 粉碎過篩后的半枝蓮粉末，精密稱定，置250 mL 圓底燒瓶中，按不同微波提取工藝提取總黃酮。粗提液經抽濾、減壓濃縮處理后過0.45 μm 水膜，定容至300 mL，按相同步驟提取2 次，即得供試品溶液。按蘆丁回歸方程計算不同微波提取工藝條件下得到的半枝蓮總黃酮質量濃度，按以下公式計算總黃酮得率。總黃酮得率（%）=［（C×300×10）/M］×100%。式中，C（mg/mL）為樣品提取液根據標準曲線所得黃酮質量濃度，常數項300 和10 為樣品稀釋倍數（體積比），M為樣品的質量（1 g）。

2.3 微波提取工藝優化

2.3.1 單因素試驗設計與結果

選擇微波提取次數（1，2，3 次）、乙醇體積分數（50%，60%，70%，80%，90%）、微波提取功率（300，400，500，600，700 W）、料液比（1 ∶15，1 ∶20，1 ∶25，1 ∶30，1 ∶35，mg/mL）、微波提取時間（6，8，10，12，14 min）進行單因素試驗，考察其對半枝蓮總黃酮得率的影響。

提取次數：由圖1 A 可見，隨著提取次數的增加，得率也增加。隨著提取次數的增加，細胞被微波穿透得越完全，總黃酮越易析出。但第3 次提取的總黃酮明顯降低，考慮到生產成本和實際提取效益的影響，將提取次數確定為2 次，在響應面法中不再討論。

乙醇體積分數：由圖1 B 可見，隨著乙醇體積分數的增加，得率呈增加趨勢，且在80%時達最高峰，原因可能是80%時，提取溶劑極性與總黃酮相似，有利于其最大程度地溶出，當乙醇體積分數大于80% 時，一些醇溶性雜質溶出增加，且隨著溶劑與總黃酮極性差距的增加，活性成分逐漸不易溶出。故80%乙醇最合適。

料液比：由圖1 C 可見，隨著料液比的不斷增加，得率不斷增加，在料液比為1 ∶25（mg/mL）時達最大值，可能是因為隨著溶劑體積的增加，溶劑與總黃酮充分接觸，溶出速度加快。料液比超過1 ∶25（mg/mL）時，總黃酮的溶解度已達到飽和，且隨著雜質溶出的增多，不利于總黃酮溶出。故料液比為1 ∶25（mg/mL）最合適。

圖1 微波提取因素對半枝蓮總黃酮得率的影響

微波提取時間：由圖1 D 可見，隨著時間的延長，得率小幅增加，在12 min 處達峰值。原因是隨著時間的延長，溶質充分溶解。但提取12 min 后，得率開始減少，可能是由于時間太長會造成黃酮結構的破壞。故微波提取12 min 最合適。

微波提取功率：由圖1 E 可見，隨著微波功率的增大，得率大幅增加，500 W 時達最大值。原因是隨著微波功率的增加，分子運動劇烈，總黃酮越易析出。當微波功率繼續增大，微波產生的強烈作用使黃酮結構遭到破壞，得率下降。故微波提取功率選500 W 最合適。

2.3.2 響應面試驗設計［12］

利用Design-Expert 8.0 軟件中Box-Behnken 的中心組合試驗設計原理，對單因素試驗進行優化，選擇乙醇體積分數（因素A）、料液比（因素B）、微波提取時間（因素C）、微波提取功率（因素D）為因素，設計4 因素3 水平的響應面試驗（共29 個試驗點）。根據軟件得出的結果分析各影響因素的影響強度，并得出最佳提取工藝條件。試驗因素水平見表1，試驗設計與結果見表2。

表1 試驗設計因素水平表

2.3.3 模型建立與方差分析

利用Design-Expert 8.0 軟件對試驗結果進行方差分析與模型擬合，得因素A，B，C，D 與得率（Y）的二次回歸方程：Y=0.07A-0.4B+0.36C+0.26D-0.093AB+0.24AC+0.16AD+0.077BC+0.46BD+0.28CB-0.39A2-0.45B2-0.37C2-0.6D2。方差分析結果見表3，可見，該二次回歸模型中F=11.43，P＜0.01，表明該模型有統計學意義；失擬項P=0.268 5 ＞0.05，表明該試驗無失擬因素存在，試驗因素選取合理；同時，回歸模型中的決定系數R2=0.919 5，正決定系數RAdj2=0.839 1，表明該方程預測數據與真實試驗數據一致性較好。因此，此模型可對微波提取半枝蓮總黃酮得率進行分析和預測。

由表3 可見，因素B 對半枝蓮總黃酮得率的影響最顯著（P＜0.01），其次是因素D 和因素C 較顯著（P＜0.05），而因素A 對試驗結果的影響較小（P＞0.05）。F值可分析出各個因素對半枝蓮總黃酮得率影響的大小順序為B ＞C ＞D ＞A。根據回歸模型中的交互項可知，BD 和CD 對黃酮得率的影響顯著（P＜0.05），表明各因素對于總黃酮得率的影響不僅是簡單的線性關系，而是存在交叉相互作用；根據回歸模型中的二次項可知，A2，B2，C2，D2對黃酮得率的影響顯著（P＜0.05），表明各因素對黃酮得率的影響很復雜。

表2 試驗設計及結果

表3 回歸方程方差分析

2.3.4 響應面分析

利用Design-Expert 8.0 軟件得到回歸模型，作出三維響應面圖和等高線圖。三維響應面圖可直觀顯示交互因素兩兩作用的最佳條件，即響應面的最高點［13-14］。等高線圖可反映出各交互因素對總黃酮得率影響的顯著性，圖形越陡，表明提取條件對總黃酮影響越大。由圖2 可見，BD（圖2 E）、CD（圖2 C）對總黃酮得率的影響顯著而其他交互項不顯著。

圖2 各因素交互作用對半枝蓮總黃酮得率的響應面圖

2.3.5 驗證試驗

分析得最佳提取工藝為乙醇體積分數80.06%、微波提取功率525.58 W、料液比1 ∶23.66（mg/mL）、微波提取時間13.1 min。在此條件下，的理論得率為10.94%。考慮實際工藝條件，修改條件為乙醇體積分數80%、微波提取功率525 W、料液比1 ∶24（mg/mL）、微波提取時間13 min。在此條件下的實際得率為10.89%，RSD為1.04%（n=3），相對偏差較小，與理論得率吻合，表明該工藝條件具有實用價值。

2.4 抗氧化活性研究

DPPH 自由基清除率測定：將微波提取得到的總黃酮提取液及陽性對照維生素C 分別配制0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL 5 個質量濃度梯度的供試品溶液。分別取2.0 mL 樣品溶液，首先加入2.5 mL 0.1 mmol/L 的DPPH 甲醇溶液，搖勻后在避光條件下充分反應2 h，在517 nm 波長處測定吸光度，每組試驗重復3 次，取平均值。以未加入總黃酮提取液的DPPH 甲醇溶液作為空白對照，按公式計算。DPPH 自由基清除率（%）= ［（A0-A1）/A0]×100%。式中，A0為空白對照吸光度，式中A1為樣品對照吸光度。

ABTS+自由基清除率測定：參照張鑫等［13］的試驗方案配置ABTS+貯備液。按上述方法將微波提取得到的總黃酮提取液及陽性對照維生素C 分別配制成樣品溶液，分別取0.6 mL，加入稀釋后的ABTS+貯備液2.4 mL，震蕩，搖勻，靜置5 min，用可見分光光度計在734 nm 波長處測定吸光度，每組試驗重復3 次，取平均值，按公式計 算。ABTS+自由基清除率（% ）= ［（A0-A1）/A0]×100%。式中，A0為空白對照吸光度，式中A1為樣品對照吸光度。

結果分析：結果見圖3，總黃酮質量濃度在0.1 ～0.5 mg/mL 范圍內，隨著質量濃度的增加，陽性對照及半枝蓮總黃酮提取液對DPPH 和ABTS+自由基的清除率不斷增加。在清除DPPH 自由基試驗中，當質量濃度達到0.4 mg/mL 時，總黃酮對DPPH 自由基清除率已與陽性對照持平，其半數清除質量濃度（IC50）為0.32 mg/mL，標準品維生素C 的IC50為0.26 mg/mL。在清除ABTS+自由基試驗中，當質量濃度達到0.4 mg/mL 時，總黃酮對ABTS+自由基清除率大幅提高，其IC50為0.32mg/mL，標準品維生素C 的IC50為0.30 mg/mL。結果顯示，半枝蓮總黃酮提取液對于DPPH 和ABTS+自由基有良好的清除效果。

圖3 半枝蓮黃酮提取液對DPPH 和ABTS+自由基的清除率

2.5 抗乙酰膽堿酯酶活性

參考文獻［14-15］，將半枝蓮總黃酮提取物配制成50 μg/mL 的供試品溶液。用移液槍取50 μg/mL 半枝蓮總黃酮提取物10 μL 和40 μL 的乙酰膽堿酯酶，加入96 孔板中的3 個復孔中，再加入110 μL 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=8），在37 ℃反應30 min，用酶標儀在412 nm 波長處測定吸光度，陽性對照品溶液為終濃度0.333μmol/L加蘭他敏，陰性對照品溶液為終濃度0.1%DMSO。每組試驗重復3 次，取平均值，根據公式計算。半枝蓮總黃酮對乙酰膽堿酯酶抑制率（%）=［（A0-A1）/A0]×100%。式中，A0為陰性對照平均吸光度值，A1為加入樣品或陽性對照的吸光度值。

結果陽性對照品溶液（加蘭他敏）和半枝蓮總黃酮提取物（50 μg/mL）對乙酰膽堿酯酶的抑制率分別為（78.32±0.7）%和（32.72±0.5）%，表明半枝蓮總黃酮提取物具有一定的抗乙酰膽堿酯酶活性作用。

3 討論

以半枝蓮為原料，以微波提取法提取的總黃酮得率為指標，采用響應面法探討5 個主要因素對提取工藝的影響。最終得到的最佳提取工藝為乙醇體積分數80%，微波提取功率525 W，料液比1 ∶24（mg/mL），微波提取時間13 min，實際得率為10.89%。與前期研究相比，該方法極大地縮短了時間，且提高了提取率，為充分利用半枝蓮總黃酮資源提供了理論依據。

現代藥理學研究表明，半枝蓮的抗氧化作用是其抗腫瘤、抗感染等的作用機制之一［16］。因此，采用DPPH 和ABTS 法測定其總黃酮提取液的自由基清除活性。本研究結果顯示，半枝蓮總黃酮有較強的DPPH，ABTS+自由基清除活性，且清除活性在一定濃度下優于維生素C。抗氧化劑可通過減少自由基的釋放產生抗阿爾茨海默病的作用［10-11］。因此，在半枝蓮總黃酮提取液具有一定自由基清除作用基礎上，采用改良的Ellman 法評價其抗乙酰膽堿酯酶活性。本研究結果顯示，半枝蓮總黃酮對乙酰膽堿酯酶有一定的抑制活性，可為活性化合物的進一步提取分離提供試驗依據，為尋找具有開發價值的抗氧化及抗乙酰膽堿酯酶化合物奠定基礎。