五味子糖漿中6 種抑菌劑篩查與分析

肖 引，王 皎，陳 江△

（1. 武警陜西省總隊(duì)醫(yī)院臨床藥學(xué)室，陜西 西安 710054； 2. 西安國際醫(yī)學(xué)中心，陜西 西安 710077）

五味子糖漿收載于2015年版《中國藥典（一部）》，具有益氣生津、補(bǔ)腎寧心功效。其制法為取五味子粉碎成粗粉，取100 g，用30%乙醇浸漬72 h 后，緩緩滲漉，收集滲漉液至相當(dāng)于原藥材的2 倍，濾過；另取蔗糖600 g，制成糖漿，加入上述濾液中，再加入苯甲酸鈉及桔子香精適量，混勻，加水調(diào)至1 000 mL［1］。制法顯示，五味子糖漿僅使用苯甲酸鈉作為抑菌劑。參考文獻(xiàn)［2-3］報(bào)道的高效液相色譜（HPLC）法，本研究中篩查了3 家不同企業(yè)10 批樣品中抑菌劑的使用情況。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BS224S 型電子分析天平（德國塞多利斯公司，精度為0.1 mg）；BP211D 型電子分析天平（德國塞多利斯公司，精度為0.1 mg）；AE 240 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度為0.1 mg）；Shimadzu LC 2030 3D型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Empower 色譜工作站（美國Waters 公司）；KQ0500-DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

苯甲酸對照品（批號為100419-201703，含量為99.9%），山梨酸對照品（批號為190126-201501，含量為99.6% ），對羥基苯甲酸甲酯對照品（批號為100278-201705，含量為100%），對羥基苯甲酸丙酯對照品（批號為100444-201403，含量為99.6%），對羥基苯甲酸丁酯對照品（批號為110792-200503，含量為100%），均由中國食品藥品檢定研究院提供；對羥基苯甲酸乙酯對照品（德國Ehrenstorfer Quality，批號為G128088，含量為99.0% ）；10 批五味子糖漿（市售品，編號為S1 ～S10）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Phenomenex C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：含0.02 mol / L 乙酸銨的0.08%冰醋酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫程度見表1；檢測波長：255 nm。理論板數(shù)按對羥基苯甲酸乙酯峰計(jì)應(yīng)不低于4 000。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

精密量取樣品5 mL，置25 mL 容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15 min，濾過，濾液作為供試品溶液。取苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯對照品，加甲醇制成每1 mL 含0.05 mg 的混合溶液，作為對照品溶液。精密量取自制苯甲酸陰性五味子糖漿5 mL，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下3 種溶液，按擬訂色譜條件各進(jìn)樣5 μL，記錄色譜圖。陰性對照品溶液色譜中，在與苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯混合對照品溶液色譜相應(yīng)位置上無相應(yīng)色譜峰。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：取苯甲酸9.89 mg、山梨酸8.50 mg、對羥基苯甲酸甲酯9.01 mg、對羥基苯甲酸乙酯9.06 mg、對羥基苯甲酸丙酯10.41mg、對羥基苯甲酸丁酯10.26mg，精密稱定，分別置50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，作為貯備溶液，將貯備溶液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.197 80，0.034 00，0.036 04，0.036 24，0.041 64，0.041 04 mg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密吸取2，6，10，15，20，25 μL 注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄其峰面積，以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯的回歸方程分別為Y苯=437 838.2X苯（r=0.999 9），Y山=10 889 020X山（r=0.999 8），Y甲酯=5 201 898X甲酯（r=0.999 9）、Y乙酯=4 837 995X乙酯（r=0.999 8）、Y丙酯=4 414 243X丙酯（r=0.999 8）、Y丁酯=4 129 725X丁酯（r=0.999 8）。結(jié)果表明，苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯進(jìn)樣量分別在0.396 ～4.945 μg，0.068 ～8.50 μg，0.0721 ～0.901 μg，0.0725 ～0.906 μg，0.083 28 ～1.041 μg，0.082 08 ～1.026 μg 范圍內(nèi)與各峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對照品溶液5 μL，重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄各組分的峰面積。結(jié)果的RSD在0.28% ～0.36%（n=6）范圍內(nèi)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h 時按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄苯甲酸和對羥基苯甲酸乙酯的峰面積。結(jié)果的RSD分別為0.23%和0.26%（n=6），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號為170201）樣品，平行量取6 份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定。結(jié)果樣品中苯甲酸的平均含量為1.475 mg / mL、RSD為1.80% （n=6），對羥基苯甲酸乙酯的含量為0.425 mg/mL、RSD為1.79% （n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批（批號為170201）樣品，精密量取6 份，每份2.5 mL，分別置容量瓶中，再各精密加入混合對照品溶液5 mL（苯甲酸質(zhì)量濃度為0.739 6 mg/mL，山梨酸質(zhì)量濃度為1.244 mg / mL、對羥基苯甲酸甲酯質(zhì)量濃度為0.463 6 mg / mL，對羥基苯甲酸乙酯質(zhì)量濃度為0.200 2 mg / mL，對羥基苯甲酸丙酯質(zhì)量濃度為0.474 mg/mL，對羥基苯甲酸丁酯質(zhì)量濃度為0.418 4 mg/mL），依法制備供試品溶液，精密吸取5 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（ n=6）

表3 10 批樣品抑菌劑含量測定結(jié)果（mg/mL）

2.4 樣品含量測定

取10 批五味子糖漿，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算苯甲酸及對羥基苯甲酸乙酯的含量。結(jié)果見表3。

3 討論

防腐劑有苯甲酸、山梨酸、尼鉑金類、苯扎氯銨類等，在多數(shù)情況下是安全的，但選擇不當(dāng)或超劑量使用會產(chǎn)生不良反應(yīng)，危害人體健康［4-5］。2015年版《中國藥典（四部）》規(guī)定了糖漿劑中添加防腐劑含量：山梨酸和苯甲酸的用量不得超過0.3% （其鉀鹽、鈉鹽的用量分別按酸計(jì)），羥苯酯類的用量不得超過0.05%［6］。苯甲酸抑菌劑對細(xì)菌的最適pH 為2.5 ～4.0。分子態(tài)苯甲酸的抑菌活性較離子態(tài)高，在pH ＜4 時，完全抑制的最低濃度為0.05% ～0.1%；當(dāng)pH ＞6 時，抑菌活性顯著降低。對羥基苯甲酸酯即尼泊金酯是國際公認(rèn)的廣譜性高效安全的食品防腐劑，廣泛用于食品、化妝品及醫(yī)藥等行業(yè)［7-9］。

結(jié)合文獻(xiàn)［10-15］，本研究中建立了五味子糖漿抑菌劑的篩查方法。10 批樣品的苯甲酸含量差異不同，較低含量可能原因?yàn)樘菨{劑長期放置過程中部分抑菌劑存在降解，試驗(yàn)結(jié)果為企業(yè)添加防腐劑限量提供了參考意義。

尼泊金酯類（對羥甲基苯甲酸乙酯）防腐劑對霉菌、酵母菌和細(xì)菌有廣泛的抗菌作用，該防腐劑的作用在于未電離分子發(fā)揮抗菌活性，抑制微生物細(xì)胞的呼吸酶系與電子傳遞酶系的活性，以及破壞微生物的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)；且隨著烷鏈的增加抗菌效力增強(qiáng)，適用于中性溶液的防腐。但通過檢測10 批樣品的pH，測定結(jié)果均在2.58 ～3.79 之間，表明五味子糖漿使用苯甲酸抑菌劑具有合理性。但沒有必要再使用對羥甲基苯甲酸乙酯防腐劑，且存在擅自改變工藝添加抑菌劑的風(fēng)險(xiǎn)。