高效液相色譜-二極管陣列檢測器法檢查復(fù)方羅布麻片Ⅰ中摻偽大花羅布麻葉方法研究*

謝思敏，劉主潔，侯惠嬋，顧利紅

（廣東省廣州市藥品檢驗所，廣東 廣州 510160）

復(fù)方羅布麻片Ⅰ是由羅布麻葉、野菊花、氫氯噻嗪等10 味中藥材、化學(xué)藥物組成的復(fù)方制劑，為治療高血壓的常用藥。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)·化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)（第十一冊）》，其中有鹽酸氯丙嗪、防己的薄層色譜鑒別和氫氯噻嗪、維生素B1/B6的液相色譜鑒別，同時還有氫氯噻嗪的含量測定方法，但并未對處方中羅布麻葉Apocynum venetumL.進(jìn)行質(zhì)量控制。日常檢驗中發(fā)現(xiàn)，羅布麻商品藥材使用較混亂，常以大花羅布麻葉Poacynum hendersonni（Hook.f）Wodson 混充羅布麻葉Apocynum venetumL. 使用。文獻(xiàn)［1-4］報道，通過測定復(fù)方羅布麻片Ⅰ中金絲桃苷、蘆丁含量，可對復(fù)方羅布麻片Ⅰ中羅布麻葉進(jìn)行質(zhì)量控制。前期研究中發(fā)現(xiàn)，以白麻苷、金絲桃苷為指標(biāo)性成分，可快速鑒別羅布麻葉和大花羅布麻葉［5-6］。為進(jìn)一步探索含羅布麻葉的復(fù)方制劑復(fù)方羅布麻片Ⅰ在生產(chǎn)過程中是否存在摻偽大花羅布麻葉，本研究中采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）法測定了復(fù)方羅布麻片Ⅰ中白麻苷、金絲桃苷的含量，可快速、準(zhǔn)確地檢查復(fù)方羅布麻片Ⅰ中是否摻偽大花羅布麻葉，并進(jìn)一步采用高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）法進(jìn)行確證。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 型二極管陣列檢測器-高效液相色譜儀，Chem-Station C 色譜工作站（美國安捷倫公司）；3200QTRAP 型液質(zhì)聯(lián)用儀，Analyst 1.7 分析軟件（美國AB 公司）；MS105型電子天平（精度為萬分之一），XP26 型電子天平（精度為百萬分之一），均購自瑞士Mettler Toledo 公司。

1.2 試藥

復(fù)方羅布麻片Ⅰ樣品（共21 批，企業(yè)A，編號為A1 ～A10；企業(yè)B，編號為B1 ～B6；企業(yè)C，編號為C1 ～C5）；羅布麻葉藥材（共8 批，編號為羅布麻葉1 ～8），大花羅布麻葉藥材（共7 批，編號為大花羅布麻葉1 ～7），均經(jīng)廣州市藥品檢驗所中藥室侯惠嬋主任中藥師鑒定為正品；羅布麻葉對照藥材（批號為120979-200704），金絲桃苷對照品（批號為111521-201708，純度為95.1%），均購自中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱中檢院）；白麻苷對照品（成都德思特生物技術(shù)有限公司，批號為DST180404-076，含量不低于98%）；甲醇、乙腈（HPLC 級，德國Merck 公司）；冰醋酸、醋酸（色譜純，美國阿拉丁公司）；自制Milli-Q 超純水；其余試劑均為分析純，均購自廣州化學(xué)試劑廠。

圖1 高效液相色譜圖

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenon Gemini C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-1%冰醋酸溶液（B），梯度洗脫（0 ～30 min 時10%A→20%A，30 ～31 min 時20%A→95%A，31 ～38 min 時95%A，38 ～39 min 時95%A→10%A，39 ～48 min 時10%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：354 nm；柱溫：50 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2 溶液制備

稱取白麻苷對照品5.79 mg、金絲桃苷對照品5.64 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得白麻苷、金絲桃苷混合對照品貯備液；精密量取混合對照品貯備液5 mL，置10 mL 容量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。取本品20 片，糖衣片除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約10 片重，精密稱定，置平底燒瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得復(fù)方羅布麻片Ⅰ供試品溶液。取藥材粉末約0.1 g，精密稱定，置平底燒瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得藥材供試品溶液。按樣品處方工藝制備缺羅布麻葉藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗：取2.2 項下對照品溶液、復(fù)方羅布麻片Ⅰ供試品溶液、陰性對照品溶液各5 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜峰。結(jié)果白麻苷、金絲桃苷的保留時間分別約為18.619 min 和25.617 min，理論板數(shù)按白麻苷峰計應(yīng)不低于10 000，基線分離良好，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察：分別精密量取混合對照品貯備液1 mL，置1，2，5，10，25，50 mL 容量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，即得系列質(zhì)量濃度對照品溶液。再分別吸取系列對照品溶液各5 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果（n=6）

精密度試驗：精密吸取2.2 項下混合對照品溶液5 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定。結(jié)果白麻苷、金絲桃苷峰面積的RSD分別為0.37%和0.13%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液（編號為A4，B5），室溫放置，分別于0，2，6，12，24 h 時按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果白麻苷、金絲桃苷峰面積的RSD分別為0.51%和0.87%（n=5），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取同一批（編號為A4）樣品6 份，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果白麻苷含量的RSD分別為0.99%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

表3 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

加樣回收試驗：取同一批（編號為A4）樣品0.5 g，精密稱定，共6 份，分別精密加入混合對照品貯備液5 mL，再精密加入70%甲醇20 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定，并計算回收率。結(jié)果見表3。

檢測限確定：取加樣回收試驗項下編號3 供試品溶液，加入70%甲醇分別稀釋250 倍（金絲桃苷質(zhì)量濃度為0.042 7 μg /mL）及500 倍（白麻苷質(zhì)量濃度為0.041 5 μg /mL），分別進(jìn)樣5 μL，取樣量以10 片計，按信噪比為3 ∶1 計算檢測限。結(jié)果復(fù)方羅布麻片Ⅰ中白麻苷、金絲桃苷的檢測限為每片0.1 μg。

2.4 樣品含量測定

分別取21 批復(fù)方羅布麻片Ⅰ樣品、收集的8 批、中檢院的1 批羅布麻葉和7 批大花羅布麻葉藥材，依法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，并計算含量。結(jié)果見表4 至表5。

表4 復(fù)方羅布麻片Ⅰ樣品含量測定結(jié)果（μg/片，n=2）

2.5 HPLC-MS 法確證

色譜柱：Agilent -poroshell 120 C18柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動相：乙腈（A）-0.5% 醋酸溶液（B），梯度洗脫（0 ～8 min 時13%A →20%A）；流速：0.4 mL/min；質(zhì)譜檢測器：電噴霧負(fù)離子模式（ESI-），選擇多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），白麻苷選擇質(zhì)荷比（m/ z）625.0（雙電荷）→300.4、m/ z625.0（雙電荷）→271.2 和m/ z625.0（雙電荷）→255.2 作為檢測離子對，金絲桃苷選擇質(zhì)荷比（m/ z）463.1（雙電荷）→300.4、m/ z463.1（雙電荷）→271.2 和m/ z463.1（雙電荷）→255.1 作為檢測離子對；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。對羅布麻葉（編號為3 ～4）、大花羅布麻葉（編號為4 ～5）及復(fù)方羅布麻片Ⅰ（企業(yè)A，編號為A3 和A4；企業(yè)B，編號為B1 和A2；企業(yè)C，編號為C1 和C5）中白麻苷、金絲桃苷的含量與HPLC-DAD 測定結(jié)果比較，RSD均小于2.5%，表明HPLC-DAD 法和HPLC-MS 法測定結(jié)果無顯著差異。

表5 羅布麻葉及大花羅布麻葉樣品測定結(jié)果（%，n=2）

3 討論

3.1 色譜條件選擇

白麻苷、金絲桃苷的全光譜掃描圖顯示，白麻苷在256 nm 和354 nm 波長處有最大吸收，而供試品溶液在354 nm 波長下，干擾少，故選擇354 nm 為檢測波長。本試驗中考察了不同的流動相、不同品牌的色譜柱，不同柱溫下白麻苷的分離情況及對測定結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，采用乙腈-1%冰醋酸溶液為流動相，在Agilent，Phenomenex，Waters 3 個品牌的色譜柱下，白麻苷、金絲桃苷均能得到有效分離，陰性對照無干擾；隨著柱溫的升高，可得到更好的分離度，故選擇50 ℃為柱溫。

3.2 樣品中摻偽情況

本試驗收集的8 批、中檢院的1 批羅布麻葉和企業(yè)B 生產(chǎn)的6 批、企業(yè)C 生產(chǎn)的5 批復(fù)方羅布麻片Ⅰ均檢出金絲桃苷，未檢出白麻苷；收集的7 批大花羅布麻葉和企業(yè)A 生產(chǎn)的11 批復(fù)方羅布麻片Ⅰ均檢出白麻苷，未檢出金絲桃苷。由此推斷，企業(yè)A 生產(chǎn)的復(fù)方羅布麻片Ⅰ中存在以大花羅布麻葉充當(dāng)羅布麻葉投料的情況；而企業(yè)B 和企業(yè)C 在生產(chǎn)中不存在摻偽大花羅布麻葉的現(xiàn)象，但其金絲桃苷含量存在較大差異。可見，對復(fù)方羅布麻片Ⅰ中的羅布麻葉進(jìn)行質(zhì)量控制十分有必要。

3.3 方法評價

本試驗中建立的方法簡便、快捷，可準(zhǔn)確檢測復(fù)方羅布麻片Ⅰ中羅布麻葉的投料情況，為提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。