一測多評(píng)法測定梔榆洗劑中4 個(gè)組分含量

許 慶，安艷蘇，畢秋左

（云南省曲靖市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，云南 曲靖 655000）

中藥臨床驗(yàn)方形成的醫(yī)院制劑具有“多成分、多靶向、君臣佐使協(xié)同作用”的特點(diǎn)，僅利用單一成分或指標(biāo)性成分對(duì)其進(jìn)行分析，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)某味藥材或制劑整體質(zhì)量的控制，需要建立良好的多指標(biāo)質(zhì)量控制評(píng)價(jià)模式［1］，但中藥制劑進(jìn)行多組分定量測定時(shí)，所需對(duì)照品短缺、價(jià)格昂貴，又制約了這一發(fā)展趨勢。一測多評(píng)（QAMS）法采用只測定藥材或制劑中某個(gè)代表性成分（易得、價(jià)廉、有效），同時(shí)又可計(jì)算其他待測成分的含量，可有效克服對(duì)照品短缺這一問題，還能對(duì)藥材或制劑進(jìn)行多指標(biāo)質(zhì)量控制［2-12］。梔榆洗劑是曲靖市中醫(yī)院的驗(yàn)方制劑，由梔子、地榆、馬齒莧、苦參、大黃、白鮮皮、地膚子薟草、荊芥、防風(fēng)、白礬11 種中藥組方，具有清熱解毒涼血、祛風(fēng)燥濕止癢功效，臨床主要用于治療濕疹、銀屑病、各種皮炎。皮膚病復(fù)雜且易反復(fù)發(fā)作，故梔榆洗劑處方中采用君臣佐使協(xié)同配伍，臨床療效確切。但現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較簡單，未采用定量方法對(duì)制劑進(jìn)行質(zhì)量控制。本研究中分別選取地榆（君藥）中沒食子酸，梔子和大黃（臣藥）中梔子苷、大黃酸、沒食子酸，防風(fēng)（佐藥）中升麻素苷為指標(biāo)成分，參照文獻(xiàn)［13-14］，建立了高效液相色譜（HPLC）法，以梔子苷為內(nèi)標(biāo)物，計(jì)算出其余組分的相對(duì)校正因子，并考察方法的耐用性及系統(tǒng)適用性，以驗(yàn)證QAMS 法在梔榆洗劑多指標(biāo)質(zhì)量控制中應(yīng)用的可行性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260 型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司，檢測器為DAD）；島津20AD 型高效液相色譜儀（日本島津公司，檢測器為DAD）；XPR2003SC 型梅特勒電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，雙量程0.1 mg /0.01 mg）；HHS226 型恒溫水浴鍋（江蘇省醫(yī)療器械廠）；密理博超純水機(jī)（美國密理博公司）。

1.2 試藥

梔子苷對(duì)照品（批號(hào)為110749-201919，含量以97.1%計(jì)），升麻素苷對(duì)照品（批號(hào)為111522-201712，含量以96.2%計(jì)），沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)為110831-201605，含量以90.8% 計(jì)），大黃酸對(duì)照品（批號(hào)為110757-201607，含量以99.3%計(jì)），均由中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇（色譜純，默克股份兩合公司，批號(hào)為11046707936）；磷酸（優(yōu)級(jí)純，成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號(hào)為201703241）；梔榆洗劑（批號(hào)分別為 SC2018002，SC2018003，SC2019001，SC2019002，SC2019003，SC2019004），缺梔子、缺防風(fēng)、缺大黃、缺地榆-大黃（缺沒食子酸）陰性對(duì)照品均由曲靖市中醫(yī)院制劑室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 QAMS 方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0 ～11 min 時(shí)5%A，11 ～15 min 時(shí)5%A→30%A，15 ～60 min 時(shí)30%A，60 ～65 min 時(shí)30%A→70%A，65 ～80 min 時(shí)70%A，80 ～81 min 時(shí)5%A，81 ～91 min時(shí)5%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：238 nm；進(jìn)樣量：5 μL。

2.1.2 溶液制備

取梔子苷、沒食子酸、升麻素苷、大黃酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為201.97，562.05，38.48，23.28 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。精密量取上述溶液各10 mL，置具塞錐形瓶中，于水浴上蒸干，精密加入甲醇10 mL，密塞，稱定質(zhì)量，水浴回流1.5 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取缺梔子、缺防風(fēng)、缺大黃、缺地榆-大黃（缺沒食子酸）陰性對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密吸取上述3 種溶液各5 μL，進(jìn)樣分析。結(jié)果各成分與鄰峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)按梔子苷峰計(jì)在3 000 以上。陰性對(duì)照品溶液在與梔子苷、升麻素苷、大黃酸、沒食子酸峰相同保留時(shí)間處無相應(yīng)色譜峰，陰性對(duì)照無干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密吸取上述混合對(duì)照品溶液1，2，3，4，5，6 μL，注入色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，以進(jìn)樣量（X）對(duì)峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸，得梔子苷、沒食子酸、升麻素苷、大黃酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。結(jié)果見表1，表明各化合物進(jìn)樣量在相應(yīng)范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表1 4 種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果（ n=6）

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.1.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄各組分峰面積。結(jié)果峰面積的RSD分別為0.81%，0.92%，0.56%，1.11%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為SC2018003），依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣測定。結(jié)果梔子苷、沒食子酸、升麻素苷、大黃酸峰面積的RSD分別為0.73%，0.94%，1.23%，1.01%（n=6），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密量取樣品（批號(hào)為SC2018003）10mL，共5 份，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定。結(jié)果梔子苷、沒食子酸、升麻素苷、大黃酸的含量分別為81.78，225.64，13.10，7.33 μg/mL，RSD分 別 為0.58% ，0.82%，1.16%，1.33%（n=5）。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取同一批（批號(hào)為SC2018003）已知含量的樣品5 mL，共6 份，分別置具塞錐形瓶中，精密加入質(zhì)量濃度梔子苷為420.2 μg/mL、沒食子酸為1 128.7 μg/mL、升麻素苷為67.1 μg/mL、大黃酸為36.8 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液1 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.1.4 相對(duì)校正因子計(jì)算

參照文獻(xiàn)［2，7］，以混合對(duì)照品溶液多個(gè)濃度點(diǎn)分別進(jìn)樣，計(jì)算所得相對(duì)校正因子的平均值fkm。本試驗(yàn)中以梔子苷為內(nèi)標(biāo)物，按公式fkm=fk/fm=Wk×Am/Wm×Ak（式中Wk為內(nèi)標(biāo)物濃度，Wm為其他待測組分濃度，Am為其他待測組分峰面積，Ak為內(nèi)標(biāo)物峰面積）分別計(jì)算3 種待測組分與梔子苷的fkm，結(jié)果見表3。

表3 梔子苷對(duì)沒食子酸、升麻素苷、大黃酸的相對(duì)校正因子

2.2 相對(duì)校正因子重復(fù)性考察

取2.1.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣1.0，1.5，3.0，4.0，5.0，6.0 μL，按2.1.4 項(xiàng)下公式計(jì)算梔子苷對(duì)沒食子酸、升麻素苷、大黃酸的相對(duì)校正因子?？疾炝? 臺(tái)不同型號(hào)的高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent1260 型及島津20AD 型）及3 種色譜柱［Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），依利特Hypersil ODS2 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Thermo Hypersil GOLD C18柱（250mm×4.6mm，5μm）］，柱間相對(duì)校正因子的RSD＜1%，表明相對(duì)校正因子在不同儀器和色譜柱上的耐用性均較好。詳見表4。

表4 不同色譜柱和儀器測得相對(duì)校正因子

2.3 待測組分色譜峰定位

表5 不同儀器及規(guī)格色譜柱下目標(biāo)成分的相對(duì)保留時(shí)間

通過相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行待測組分峰的定位，結(jié)果見表5?？梢?，各待測組分相對(duì)保留值的RSD＜3.0 %，根據(jù)不同儀器及規(guī)格色譜柱下目標(biāo)成分的相對(duì)保留時(shí)間可正確判斷目標(biāo)峰的準(zhǔn)確位置。

表6 ESM 法和QAMS 法測定梔榆洗劑中4 種成分含量比較（μg/mL，n=6）

2.4 QAMS 法與外標(biāo)（ESM）法測定結(jié)果比較

精密吸取供試品溶液各5 μL，注入高效液相色譜儀測定，采用QAMS 法與ESM 法計(jì)算樣品中梔子苷、沒食子酸、升麻素苷、大黃酸的含量。結(jié)果見表6。采用統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算2 種方法的沒食子酸、升麻素苷、大黃酸含量之間的Pearson 系數(shù)。結(jié)果表明，2 種方法所測得含量相似度較高；兩組含量的RSD均在2%內(nèi)，表明2 種方法測得各批次樣品的含量無顯著差異，QAMS 法可應(yīng)用于梔榆洗劑各組分的含量測定。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇

供試品溶液提取時(shí)考察了甲醇超聲提取與水浴回流提取2 種方法，發(fā)現(xiàn)后者提取率更高，故選擇后者。水浴回流提取0.5，1.0，1.5，2.0 h，結(jié)果1.5 h 后含量提取變化不大，故采取甲醇水浴回流1.5 h，制劑中4 個(gè)組分提取效率高，分離度好，雜質(zhì)干擾峰較少，方法簡單易行。

3.2 檢測波長選擇

對(duì)梔子苷、沒食子酸、升麻素苷、大黃酸進(jìn)行全波長掃描，在238 nm 和254 nm 波長處均有吸收，并比較238 nm 和254 nm 波長下的色譜圖，結(jié)果238 nm波長處各主成分峰靈敏度高、干擾較少，被選為檢測波長。

3.3 校正因子考察

為驗(yàn)證所建立4 個(gè)組分QAMS 法的適用性及可行性，本研究中進(jìn)行了方法學(xué)考察及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。通過2 臺(tái)液相色譜儀、3 根不同品牌及型號(hào)色譜柱的考察，結(jié)果表明沒食子酸、升麻素苷、大黃酸與梔子苷之間的相對(duì)校正因子具有良好的重復(fù)性。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的QAMS 法應(yīng)用于梔榆洗劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)，以梔子苷為內(nèi)標(biāo)物，分別確定沒食子酸、升麻素苷、大黃酸的相對(duì)校正因子，分別采用ESM 法和QAMS法測定4 種成分的含量，并通過RSD和Pearson 系數(shù)比較兩者的相對(duì)誤差。QAMS 法所得4 種成分的含量與傳統(tǒng)ESM 法測得結(jié)果無顯著差異，且與ESM 法相比，可節(jié)約檢測成本，有利于制劑的質(zhì)量控制，可為醫(yī)院制劑多成分定量分析提供參考。