洗四方袋泡劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

黃振忠，袁經(jīng)權(quán)，唐炳蘭，潘 宇，周陽曉，陳 路△

（1. 廣西壯族自治區(qū)貴港市中西醫(yī)結(jié)合骨科醫(yī)院，廣西 貴港 537100； 2. 廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧 530023； 3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001）

洗四方袋泡劑是廣西壯族自治區(qū)貴港市中西醫(yī)結(jié)合骨科醫(yī)院臨床使用30 多年的驗(yàn)方，作為治療骨科損傷疾病后期功能康復(fù)的外用熏洗協(xié)定方劑，具有活血化瘀、舒筋通絡(luò)功效。洗四方袋泡劑由雞血藤、大黃、三叉苦、白背葉、雞骨香等11 味中藥組方，用于骨科損傷疾病后期的功能康復(fù)、軟組織損傷、腰腿痛及手足凍瘡等的治療［1-2］。方中雞血藤為君藥，行血補(bǔ)血，通經(jīng)活絡(luò)；白背葉、雞骨香散瘀止痛，祛風(fēng)活血［3］；三叉苦消腫止痛［4］；大黃涼血、祛瘀、解毒［5］。該制劑在提取工藝、臨床用藥的安全性等方面均有報(bào)道［6-8］，為控制其質(zhì)量，確保臨床用藥有效，本研究中通過薄層色譜（TLC）法定性鑒別該制劑中的雞血藤、三叉苦和大黃藥材，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定制劑中大黃酸的含量，以期為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

VARIAN 210 型高效液相色譜儀（UV 檢測(cè)器，美國瓦里安公司）；BSA124S 型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，精度為0.1 mg）；SB-5200D 型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）；UV-1240 型紫外可見分光光度計(jì)（日本Shimadzu UV 公司）；ZF-8 型暗箱式四用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）。

1.2 試藥

雞血藤對(duì)照藥材（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為170621）；三叉苦對(duì)照藥材（批號(hào)為121682-201301），大黃對(duì)照藥材（批號(hào)為120984-201202），大黃酸對(duì)照品（批號(hào)為110757-201607），均購自中國食品藥品檢定研究院；雞血藤（批號(hào)為180601），三叉苦（批號(hào)為180401），大黃（批號(hào)為180701），均購自廣西玉林市至真中藥飲片有限責(zé)任公司；洗四方袋泡劑（批號(hào)分別為201810，201811，201812），廣西壯族自治區(qū)貴港市中醫(yī)結(jié)合骨科醫(yī)院院內(nèi)制劑；甲醇、磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜（TLC）鑒別

三叉苦：取3 批樣品各5 g，加95%乙醇50 mL，加熱回流1 h，冷卻，濾過，濾液蒸干，加水40 mL，超聲處理20 min，過濾，用醋酸乙酯萃取2 次，每次20 mL，合并2 次醋酸乙酯液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液；取三叉苦藥材粉末1 g，按供試品溶液制備方法制備供試藥材溶液，取三叉苦對(duì)照藥材粉末1 g，按供試品溶液制備方法制備對(duì)照藥材溶液；取缺三叉苦的陰性樣品5 g，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。按2015年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗(yàn)，吸取上述4 種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲酸-水（5 ∶5 ∶1 ∶0.5，V/ V/ V/ V）為展開劑［10］，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同亮藍(lán)色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾（見圖1 B）。

大黃：取3 批樣品各2 g，加水40 mL 回流提取1 h，冷卻，濾過，濾液加醋酸乙酯萃取3 次，每次20 mL，合并3 次醋酸乙酯萃取液，水浴蒸干，殘?jiān)右掖? mL 使溶解，作為供試品溶液；取大黃酸對(duì)照品0.001 0 g，精密稱定，加乙醇1 mL 制成質(zhì)量濃度為1 mg /mL 的大黃酸對(duì)照品溶液；取大黃藥材粉末0.1 g，按供試品溶液方法制備供試藥材溶液，取大黃對(duì)照藥材粉末0.1 g，按供試品溶液方法制備對(duì)照藥材溶液；取缺大黃的陰性樣品2 g，按供試品溶液方法制備陰性對(duì)照品溶液。按2015年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗(yàn)，吸取上述5 種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H 薄層板上，以現(xiàn)配的石油醚（60 ～90 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（11 ∶6 ∶1，V/ V/ V）上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干。在254 nm 波長的紫外燈下檢視，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同棕色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾［5，11］（見圖1 C）。

圖1 薄層色譜圖

圖2 高效液相色圖譜

2.2 大黃酸含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠Agilent XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（80 ∶20，V/ V）；檢測(cè)波長：254 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下，理論板數(shù)按大黃酸峰計(jì)應(yīng)不低于3 000。

2.2.2 溶液制備

取大黃酸對(duì)照品4.4 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為44 μg/mL的對(duì)照品貯備液；精密移取對(duì)照品貯備液5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度為22 μg/mL 的對(duì)照品溶液。取樣品3 g，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，精密加入25 mL 甲醇，密閉加塞，稱定質(zhì)量，回流提取1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，精密吸取續(xù)濾液10 mL 置燒瓶中，水浴揮去溶劑，加入10 mL 8%鹽酸溶液，超聲處理2 min，再加入10 mL 三氯甲烷，回流提取1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌圓底燒瓶，一同并入分液漏斗中，振搖，混合均勻，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3 次，每次10 mL，合并三氯甲烷層，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓D(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液［5］。另按處方工藝取缺大黃的陰性樣品3 g，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密吸取2.2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖2。結(jié)果顯示，大黃酸色譜峰分離效果良好，且陰性對(duì)照無干擾。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取對(duì)照品貯備液（質(zhì)量濃度為44 μg/mL）1，2，3，4，5，6，7，8 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經(jīng)微孔濾膜濾過，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以大黃酸進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、色譜峰峰面積值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=89.306X+2.500，R2=0.999 7（n=8）。結(jié)果表明，大黃酸進(jìn)樣量在0.044 ～0.352 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2)采用模糊控制理論，設(shè)計(jì)MSJ5.8/1.6D型礦山豎井掘進(jìn)機(jī)的偏斜控制系統(tǒng)，能夠針對(duì)豎井掘進(jìn)機(jī)的偏斜特點(diǎn)進(jìn)行合理的糾偏操作。通過試驗(yàn)，證實(shí)了控制系統(tǒng)的可靠性。良好的糾偏能力不僅減少了豎井掘進(jìn)機(jī)的鉆進(jìn)、支護(hù)等建井成本，還提高了井壁質(zhì)量，本系統(tǒng)在實(shí)際的豎井掘進(jìn)機(jī)鑿井工程中有著廣闊的應(yīng)用前景。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2.2 項(xiàng)下大黃酸對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為22 μg / mL）適量，按擬訂色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6 次，依法測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果大黃酸峰面積的RSD為0.99%（n =6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)為201810），分別于0，1，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果大黃酸峰面積的RSD為0.89%（n=6），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為201810）樣品適量，精密稱定，依法平行制備6 份供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果大黃酸平均含量為0.160 4 mg/g，RSD為1.64%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取9 份已知含量的樣品（批號(hào)為201810，大黃酸為0.160 4 mg/g）適量，依次精密加入對(duì)照品貯備液3，6，9 mL，各3 份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 大黃酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取3 批（批號(hào)分別為201810，201811，201812）樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算大黃酸含量。結(jié)果3 批樣品中大黃酸含量分別為0.160 4，0.162 5，0.138 2 mg/g。

3 討論

3.1 薄層色譜條件優(yōu)化

雞血藤：供試品溶液制備時(shí)采用乙醇為超聲提取溶劑，但效果不理想，將超聲提取溶劑改成甲醇后，斑點(diǎn)濃度較大，清晰可見，分離好，陰性對(duì)照無干擾［3］；選擇二氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸（8 ∶1.2 ∶0.3 ∶0.5，V/ V/V/ V）作為展開劑［3］，但結(jié)果Rf值較小且斑點(diǎn)拖尾，通過系統(tǒng)考察，選取環(huán)己烷-甲酸乙酯-冰醋酸-甲酸-異丙醇（5 ∶5 ∶0.5 ∶0.5 ∶1，V / V / V / V / V）作為展開劑［9］，分離效果較好；香草醛鹽酸溶液為顯色劑，結(jié)果斑點(diǎn)清晰，但顯色后斑點(diǎn)消失太快，后改進(jìn)為顯色劑現(xiàn)用現(xiàn)配，斑點(diǎn)保留時(shí)間較久。

三叉苦：對(duì)供試品溶液的提取溶劑、提取方法做了系統(tǒng)考察［12-14］，結(jié)果采用95%乙醇提取的方法，斑點(diǎn)分離清晰，陰性對(duì)照無干擾；展開劑選擇甲苯-醋酸乙酯-甲酸-水（5 ∶5 ∶1 ∶0.5，V/ V/ V/ V）［10］，結(jié)果斑點(diǎn)不清晰，改成展開劑靜置30 min 后，取上層溶液，置紫外光燈（254 nm）下進(jìn)行檢視，結(jié)果分離效果佳，斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無干擾。

大黃：展開劑的選擇參考2015年版《中國藥典（一部）》中大黃藥材鑒別及文獻(xiàn)［11］的方法，先以石油醚（30 ～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15 ∶5 ∶1，V/ V/ V）為展開劑，但溶劑易揮發(fā)、易分層、展開時(shí)斑點(diǎn)稍有堆積；后將石油醚（30 ～60 ℃）改為石油醚（60 ～90 ℃），并將展開劑比例調(diào)為石油醚（60 ～90 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（11 ∶6 ∶1，V/ V/ V），現(xiàn)配現(xiàn)用，結(jié)果斑點(diǎn)分離效果好，Rf值適中，且無拖尾現(xiàn)象。故選擇石油醚（60 ～90 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（11 ∶6 ∶1，V/ V/ V）為展開劑。

3.2 檢測(cè)波長選擇

采用紫外可見分光光度計(jì)在190 ～600 nm 波長范圍內(nèi)對(duì)大黃酸對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果在254 nm 波長處有最大吸收峰。檢測(cè)波長確定為254 nm。

3.3 流動(dòng)相選擇

由于洗四方袋泡劑含多種中藥，成分復(fù)雜，故需選擇合適的流動(dòng)相進(jìn)行分析。曾考察甲醇-0.1%磷酸溶液的流動(dòng)相系統(tǒng)，甲醇-0.1%磷酸溶液（85 ∶15，V/ V）［5］時(shí)主峰與雜峰分離效果差；甲醇-0.1%磷酸溶液流動(dòng)相為（75 ∶25，V/ V）［15］時(shí)保留時(shí)間過長；甲醇-0.1%磷酸溶液流動(dòng)相為（80 ∶20，V/ V）時(shí)峰型好，峰面積合適，且與雜峰的分離效果好，均達(dá)到要求。故選擇后者。

3.4 色譜條件選擇

曾以DIKMA C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），ULTIMATE×B C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Agilent XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）及 Agilent XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）對(duì)樣品溶液進(jìn)行含量測(cè)定。以DIKMA C18柱和Agilent XDB -C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）測(cè)得樣品溶液的保留時(shí)間短，且大黃酸與前后峰分不開，故不被選擇；而ULTIMATE × B C18柱測(cè)得樣品溶液的保留時(shí)間較好，但峰型差，理論板數(shù)較低，故不被采納；而Agilent XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱測(cè)得樣品溶液中的大黃酸保留時(shí)間合適，且與前后雜質(zhì)峰的分離度均大于4，峰型和分離度均良好，符合《中國藥典》的規(guī)定，故選用該色譜柱。

3.5 方法評(píng)價(jià)

曾對(duì)洗四方袋泡劑中雞血藤、三叉苦和大黃藥材進(jìn)行TLC 鑒別，斑點(diǎn)清晰，供試品溶液與對(duì)照品溶液的斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)良好，陰性對(duì)照無干擾；以HPLC 法測(cè)定洗四方袋泡劑中大黃酸的含量，分離效果好，峰形良好，保留時(shí)間適宜，專屬性強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)測(cè)定方法穩(wěn)定。本研究中所建立的方法可靠、準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單，可確保產(chǎn)品的質(zhì)量和療效，保證患者用藥安全。