祛瘀生新膠囊化學(xué)成分超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析及含量測(cè)定*

陳 娟，狄志彪，王 娣，穆慶麗，郭 冬

（陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003）

祛瘀生新膠囊為陜西省中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑（陜藥制字Z20150050），由三棱、莪術(shù)、桂枝、黃芪、土貝母、制馬錢子粉6 味中藥組方，具有破血行氣、散結(jié)止痛功效，用于治療風(fēng)寒濕邪等多種原因引起的髖部疼痛、腫脹、屈伸活動(dòng)受限、行走困難等功能障礙性疾病，臨床適用于股骨頭無(wú)菌性壞死（Ⅰ-Ⅱ期）引起的髖關(guān)節(jié)疼痛［1-3］。該制劑中有23 個(gè)化學(xué)成分，本研究中以其中的活性成分黃芪甲苷［4］、有效成分及毒性成分士的寧［5］為含量測(cè)定指標(biāo)，建立了祛瘀生新膠囊中士的寧含量測(cè)定的高效液相色譜（HPLC）法和黃芪甲苷含量測(cè)定的高效液相色譜-蒸光發(fā)散射檢測(cè)器（HPLC-ELSD）法，以使其質(zhì)量可控。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Scientific Q Exactive Focus 型質(zhì)譜儀，Thermo Fisher U3000 型超高效液相色譜儀，均購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；BS210S 型電子天平（精度為萬(wàn)分之一），BT25S 型電子天平（精度為十萬(wàn)分之一），均購(gòu)自北京賽多利斯天平有限公司；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；KH-300D 型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

士的寧對(duì)照品（批號(hào)為110705-200306），黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)為110746-200620），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；祛瘀生新膠囊（陜西省中醫(yī)醫(yī)院自制，批號(hào)分別為20181201，20181202，20181203，規(guī)格為每粒0.3 g）；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）定性分析

2.1.1 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Accucore AQ C18柱（150 mm×150 mm，2.6 μm）［6-7］；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0 ～10 min 時(shí)95%A ～40%A，10 ～20 min 時(shí)40%A ～5 %A，20 ～22 min 時(shí)5%A）；流速為0.3 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為3 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（HESI）；噴霧電壓為3.50kV；離子傳輸管溫度為320 ℃；鞘氣流速為40 arb；輔助氣體流速為30 arb；輔助氣體溫度為350 ℃；掃描方式為Full MS/dd-MS2；采集范圍為質(zhì)荷比（m/ z）100 ～1 500；采集模式為正離子模式［8］。

2.1.2 溶液制備

取本品約0.3 g，精密稱定，置100 mL 具塞錐形瓶中，加入50 mL 75%甲醇水溶液，超聲提取30 min（功率為300 W，頻率為50 kHz），吸取上清液5 mL，置50 mL容量瓶中，用75%甲醇水溶液定容，0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.1.3 定性分析

采用正離子模式進(jìn)行定性分析。根據(jù)各色譜峰的一級(jí)碎片離子m/ z、保留時(shí)間、分子離子峰及主要的二級(jí)碎片離子，參照相關(guān)文獻(xiàn)和化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的化學(xué)成分，對(duì)色譜圖進(jìn)行了峰歸屬分析，初步鑒定出23 個(gè)主要化學(xué)成分，23 個(gè)化合物成分及其相關(guān)質(zhì)譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。祛瘀生新膠囊的質(zhì)譜總離子流圖見(jiàn)圖1。

圖1 祛瘀生新膠囊樣品總離子流圖

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

士的寧：色譜柱為Welchrom C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸水溶液（15 ∶85，V/ V）；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min。士的寧的分離度不得低于1.5，理論板數(shù)不低于5 000。

黃芪甲苷：色譜柱為Welchrom C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（32 ∶68，V/ V）；流速為1.0 mL / min；柱溫為30 ℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，漂移管溫度為60 ℃；流速為2.2 mL/min；載氣壓為0.5 MPa。黃芪甲苷的分離度不得低于1.5，理論板數(shù)不低于5 000。

表1 祛瘀生新膠囊主要化學(xué)成分UPLC-MS/MS 定性分析結(jié)果

2.2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取士的寧對(duì)照品適量，精密稱定，加三氯甲烷溶解并制成質(zhì)量濃度為0.055 mg/mL 的士的寧對(duì)照品溶液。取黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并制成質(zhì)量濃度為0.245 mg/mL 的黃芪甲苷對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取本品約0.3 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加三氯甲烷20 mL 和氨水1 mL，水浴加熱回流1 h，放冷濾過(guò)，濾渣用三氯甲烷洗滌3 次，每次20 mL，合并濾液和洗液，置水浴蒸干，蒸干后殘?jiān)尤燃淄槿芙獠⒍哭D(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，以三氯甲烷定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得士的寧供試品溶液。取本品約9.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇100 mL，超聲處理45 min，濾過(guò)，濾液置水浴蒸干，加160 mL 水溶解，用水飽和正丁醇振搖提取4 次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2 次，每次40 mL，棄去氨試液，正丁醇液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，以甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得黃芪甲苷供試品溶液。

陰性對(duì)照品溶液：按處方工藝分別制備缺制馬錢子和缺黃芪的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別吸取士的寧對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，進(jìn)樣分析。結(jié)果士的寧峰形良好，與相鄰色譜峰能達(dá)到基線分離，陰性對(duì)照品溶液在士的寧色譜圖主峰位置無(wú)對(duì)應(yīng)峰出現(xiàn)，表明陰性對(duì)照無(wú)干擾。同法測(cè)得處方中其他成分對(duì)黃芪甲苷的含量測(cè)定無(wú)影響。色譜圖見(jiàn)圖2。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取士的寧對(duì)照品溶液和黃芪甲苷對(duì)照品溶液各2，4，8，12，16，20 μL，按各自擬訂的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X）進(jìn)行線性回歸，得士的寧回歸方程Y=2 241.6X-6.499 2（r=0.999 9）。結(jié)果表明，士的寧進(jìn)樣量在0.11 ～1.10 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。以黃芪甲苷峰面積的自然對(duì)數(shù)值（Y）對(duì)黃芪甲苷進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)值（X）進(jìn)行線性回歸，得黃芪甲苷回歸方程Y=1.343 4X+4.467 3（r=0.999 2）。結(jié)果表明，黃芪甲苷進(jìn)樣量在0.49 ～4.90 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一士的寧對(duì)照品溶液和黃芪甲苷對(duì)照品溶液各10 μL，按各自擬訂的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積。結(jié)果士的寧、黃芪甲苷峰面積的RSD分別為0.41%和0.46%（n=6），表明儀器的精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)為20181201）6 份，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果士的寧的平均含量為1.474 0 mg/g、RSD為1.45% （n=6），黃芪甲苷的平均含量為0.244 3 mg/g、RSD為0.77% （n=6），表明方法重復(fù)性良好。

圖2 高效液相色譜圖

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12 h 時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄各時(shí)間點(diǎn)的峰面積。結(jié)果士的寧峰面積的RSD為1.38%（n=7），黃芪甲苷峰面積的RSD為1.25% （n=7），表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

耐用性試驗(yàn)：取2.2.2 項(xiàng)下供試品溶液，按擬訂色譜條件（分別調(diào)整柱溫、流速和色譜柱）同法測(cè)定，考察士的寧和黃芪甲苷的含量變化。結(jié)果士的寧的平均含量為1.495 0 mg/g、RSD為0.56%，黃芪甲苷的平均含量為0.244 0 mg/g、RSD為0.43%，表明方法耐用性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為20181201）0.15 g，平行取6 份，精密稱定，每份樣品加入質(zhì)量濃度為0.055 mg/mL 的士的寧標(biāo)準(zhǔn)品溶液4 mL；取已知含量的樣品（批號(hào)為20181201）4.65 g，平行取6 份，精密稱定，每份樣品加入質(zhì)量濃度為0.406 mg/mL的黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液3 mL。分質(zhì)量別依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，并計(jì)算士的寧和黃芪甲苷的加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.4 樣品含量測(cè)定

分別取3 批樣品（批號(hào)分別為20181201，20181202，20181203），依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算樣品中士的寧和黃芪甲苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 測(cè)定指標(biāo)選擇

三棱為方中君藥，能破血行氣、散結(jié)止痛。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選制劑中的成分，從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）、美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）和中醫(yī)百科全書（ETCM）3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中共獲得551 個(gè)成分。經(jīng)ADME 虛擬篩選，潛在活性成分為223 個(gè)，通過(guò)靶點(diǎn)識(shí)別和疾病映射共獲得活性成分136 個(gè)；通過(guò)分子網(wǎng)絡(luò)分析，篩選出關(guān)鍵活性成分為亞油酸、蘆丁、2-甲基-N-苯基馬來(lái)酰亞胺、士的寧，黃芪甲苷、二氫丁香酚等10 個(gè)成分；再次采用UPLC-MS/MS 法鑒定出該制劑中有蔗糖、士的寧、馬錢苷酸、蘆丁、黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪異黃烷苷等23 個(gè)主要化學(xué)成分，與上述重疊的成分主要為蘆丁、士的寧和黃芪甲苷。蘆丁（三棱總黃酮）具有較強(qiáng)的抗血小板聚集、抗血栓、鎮(zhèn)痛作用，是破血化癖的有效活性部位［9］，其含量測(cè)定方法已制訂［10］。制馬錢子可散血熱、消腫止痛，也可調(diào)和諸藥，士的寧是馬錢子鎮(zhèn)痛主要活性生物堿，含有毒性［11-12］，應(yīng)作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量控制指標(biāo)性成分之一。士的寧可用于偏癱、癱瘓及因注射鏈霉素引起的骨骼肌松弛、弱視癥等［13］，對(duì)脊髓、延髓、大腦皮質(zhì)等神經(jīng)系統(tǒng)及消化系統(tǒng)有一定的藥理作用［14］。黃芪可補(bǔ)氣行氣，黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪異黃烷苷均為其主要化學(xué)成分，其中黃芪甲苷為活性成分之一，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫、增強(qiáng)機(jī)體耐缺氧及應(yīng)激能力、治療糖尿病、抗病毒等作用［15-16］。因此，將士的寧和黃芪甲苷作為祛瘀生新膠囊的質(zhì)量控制指標(biāo)性成分具有可行性。

3.2 UPLC-MS/MS 條件篩選

基于UPLC-MS/MS 技術(shù)分析方法，對(duì)樣品分別進(jìn)行了正、負(fù)離子質(zhì)譜掃描，結(jié)果在正離子掃描模式下化合物具有較好的響應(yīng)值，而在負(fù)離子掃描模式下化合物響應(yīng)較差，分析得到的化合物數(shù)量很少。因此，本研究中采用正離子掃描模式對(duì)樣品進(jìn)行全面分析和測(cè)定。

3.3 供試品制備方法選擇

由于該制劑中的中藥成分復(fù)雜，干擾成分較多，在測(cè)定士的寧時(shí)進(jìn)行了超聲提取和回流提取，結(jié)果回流提取的士的寧含量較高，故選擇回流提取。通過(guò)對(duì)祛瘀生新膠囊前處理、對(duì)供試品制備方法的優(yōu)化（包括樣品的超聲提取，超聲時(shí)間和正丁醇提取次數(shù)和用量及氨洗次數(shù)和用量），發(fā)現(xiàn)本研究中的處理方法簡(jiǎn)便且優(yōu)化。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中采用HPLC 法和HPLC-ELSD 法分別測(cè)定士的寧和黃芪甲苷的含量，靈敏度高，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)。